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Western一抗二抗去除液(弱堿,溫和型)

Western一抗二抗去除液(弱堿,溫和型)

產(chǎn)品編號(hào):WS1200-500ml

產(chǎn)品規(guī)格:500ml

相關(guān)規(guī)格:
數(shù)量
價(jià)格 ¥300

Western一抗二抗去除液(弱堿,溫和型)

貨號(hào)

名稱

規(guī)格

WS1200-100ml

Western一抗二抗去除液(弱堿,溫和型)

100 ml

WS1200-500ml

Western一抗二抗去除液(弱堿,溫和型)

500 ml







● 產(chǎn)品簡(jiǎn)介:

Western一抗二抗去除液(弱堿,溫和型)(Western Antibody Stripping Buffer,weak alkaline,mild type)可以高效去除印跡膜上的一抗和二抗,而吸附在膜上的抗原基本不受影響,用于Western中轉(zhuǎn)移了蛋白膜的重復(fù)利用,可以轉(zhuǎn)一次膜,做多次Western印跡實(shí)驗(yàn),通常可以重復(fù)利用膜5-8次(PVDF膜)。使用本試劑只需大約30分鐘即可實(shí)現(xiàn)蛋白膜的重復(fù)使用,然后可以進(jìn)行Western的后續(xù)操作。

該產(chǎn)品具有以下幾個(gè)優(yōu)點(diǎn):

1.可用于昂貴或珍稀樣本的多次雜交;

2.有利于用不同抗體分析單次印跡上的不同蛋白,比如不同亞型的抗體;

3.有利于對(duì)異常結(jié)果進(jìn)行重新分析或確認(rèn);

4.有利于糾正孵錯(cuò)的抗體;

5.節(jié)約試劑成本,并節(jié)約時(shí)間。

各種去除液的選擇請(qǐng)點(diǎn)擊Western一抗二抗去除液選擇指南。

● 貯存:

   常溫貯存,有效期一年;常溫運(yùn)輸。

● 用前必讀:

1. 理想的抗體去除液應(yīng)該是洗脫抗體的同時(shí),不洗脫膜上結(jié)合的蛋白或者不改變抗原的結(jié)合性質(zhì),但是目前沒(méi)有一種去除液可以做到只洗脫抗體,而完全不洗脫膜上結(jié)合的抗原;也沒(méi)有一種去除液可以適用于所有不同親和度的抗原抗體復(fù)合物。去除液洗脫能力太強(qiáng),抗原也容易被洗脫;太弱,則抗體殘留太高。因此,從免疫印跡膜上去除抗體的方案僅能用于定性用途,因?yàn)樵诿總€(gè)抗體清除循環(huán)中,或多或少都將洗去少量膜上的蛋白。

2. PVDF膜比硝酸纖維素膜(NC膜)更堅(jiān)韌,因此優(yōu)先推薦使用PVDF膜用于涉及抗體剝離的實(shí)驗(yàn)。

3. 從SDS-PAGE凝膠轉(zhuǎn)印完成后立即干燥PVDF膜或NC膜,可改善蛋白質(zhì)與膜的結(jié)合,特別推薦用于涉及多次抗體剝離的實(shí)驗(yàn)。在第一輪抗體檢測(cè)之前,必須使用甲醇將干燥的PVDF膜潤(rùn)濕或用1×TBST將干燥的NC膜潤(rùn)濕。已經(jīng)結(jié)合有抗體的膜,決不能使得膜干燥,否則抗體分子將與膜結(jié)合緊密,很難剝離。因此,在做完一輪ECL發(fā)光檢測(cè)實(shí)驗(yàn)后,需要用清除液清除掉膜上的抗體,推薦將膜浸泡于1×TBS(非1×TBST)中4度保存。

4. 檢測(cè)時(shí),優(yōu)先檢測(cè)低豐度抗原:先孵育條帶較弱(表達(dá)較低)的蛋白,再孵育條帶明顯(表達(dá)較高)的蛋白,最后再孵育內(nèi)參。


5. 如條件允許,下一輪的抗體雜交實(shí)驗(yàn)選擇種屬來(lái)源不同的一抗(對(duì)應(yīng)不同種屬的二抗),減少檢測(cè)的交叉反應(yīng)。

6. 該清除液適用于ECL發(fā)光檢測(cè)的膜上抗體清除,不適合于膜上直接顯色(DAB,BCIP/NBT等),不適合熒光檢測(cè)。

● 使用說(shuō)明:

1. 在完成Western化學(xué)發(fā)光檢測(cè)后,NC膜或PVDF膜用適量蒸餾水中震蕩漂洗5分鐘;重復(fù)漂洗2次。

2. 棄蒸餾水,加入適量的Western一抗二抗去除液,根據(jù)下表操作。孵育溫度和時(shí)間會(huì)明顯影響抗體去除效果,參照下表調(diào)整。

操作溫度

震蕩清除時(shí)間

備注

18

30分鐘以上

冬天實(shí)驗(yàn)室氣溫低時(shí)

25

~30 分鐘

常規(guī)樣品操作

推薦37

10-25分鐘

膜上蛋白含量高的樣品或清除與膜親和力高的抗體

3. 棄去除液,加入足量蒸餾水,在搖床上漂洗2次,每次5分鐘,把去除液徹底漂洗干凈。

  注:殘余的去除液會(huì)影響后續(xù)抗原抗體的的結(jié)合。

4. 可選步驟:漂洗后的轉(zhuǎn)印膜孵育ECL發(fā)光液,檢測(cè)二抗的清除效率。曝光5-10分鐘,膜上看不到發(fā)光條帶表明二抗清除得比較干凈。如果膜上能看到條帶,重復(fù)步驟2-3。

5.繼續(xù)進(jìn)行Western的后續(xù)操作(封閉-抗體孵育-發(fā)光檢測(cè))。

   注:建議每次膜剝離后都要進(jìn)行重新封閉,以降低背景。

● 實(shí)驗(yàn)示例:


樣品:K562細(xì)胞,SDS裂解液(貨號(hào):RL1060)提取總蛋白;

電泳:4-20% RealPAGE預(yù)制膠(貨號(hào):RTD6117-0420)電泳

轉(zhuǎn)膜:NC膜,1×RealBlot快速轉(zhuǎn)膜液(貨號(hào):RT5020)快速濕轉(zhuǎn),恒流400 mA 30 min

圖1:Western快速封閉液(貨號(hào):WR5020)RT 快封  15 min;一抗:β-Actin鼠單抗 1:10000  RT 60min;二抗:羊抗鼠IgG-HRP 1:5000  RT 60min;ECL(貨號(hào):EC2520)曝光1秒。

圖2: Western一抗二抗去除液(弱堿,溫和型) RT 20分鐘剝離,ECL曝光11分鐘,二抗去除干凈。

圖3: Western快速封閉液(貨號(hào):WR5020)RT 快封20分鐘;一抗:PCNA鼠單抗1:5000 RT 60min,二抗羊抗鼠IgG-HRP 1:5000,ECL(貨號(hào):EC2520)曝光1秒。

圖4: 膜第二次剝離RT 30分鐘,ECL自動(dòng)曝光11min ,二抗去除干凈

圖5: Western快速封閉液(貨號(hào):WR5020)RT 快封30min;一抗:GAPDH兔多抗 1:3000 60min,二抗:羊抗兔IgG-HRP RT 60min,ECL曝光2分16秒。


Western一抗二抗去除液(弱堿,溫和型) PVDF膜測(cè)試

樣品:K562細(xì)胞,SDS裂解液(貨號(hào):RL1060)提取總蛋白

電泳條件:12% RealPAGE預(yù)制膠(貨號(hào):RTD6117-0012), 恒壓150 V 1×TGS  73 min

轉(zhuǎn)膜條件:PVDF膜 孔徑0.45μm,1×RealBlot快速轉(zhuǎn)膜液(貨號(hào):RT5020) 恒流400 mA 30 min

封閉:無(wú)蛋白快速封閉液(貨號(hào):PF1070)常溫封閉10 min

膜去除抗體程序:37度,搖床60rpm 10分鐘

圖1:一抗:PCNA鼠單抗 1:5000,RT 60min;二抗:羊抗鼠IgG-HRP 1:5000  RT 60min,ECL曝光1秒

圖2:膜第1次清除后抗體去除效果檢測(cè):膜水漂洗3次,加入5 ml抗體去除液去除抗體,TBST漂洗3次,ECL曝光5分鐘,膜上幾乎無(wú)可見條帶,說(shuō)明二抗去除干凈。

圖3:膜第1次清除后,H3檢測(cè): H3鼠單抗 1:10000  RT  60 min孵育,羊抗鼠IgG-HRP 1:5000  RT 60min孵育,ECL曝光5秒。

圖4:膜第2次清除后,GAPDH檢測(cè): GAPDH兔多抗 1:3000  RT 60 min孵育,羊抗兔IgG-HRP 1:5000  RT 60min,ECL曝光150秒。

圖5:膜第3次清除后,PCNA檢測(cè):PCNA鼠單抗 1:5000  RT  60 min孵育,羊抗鼠IgG-HRP 1:5000  RT 60min孵育,ECL曝光1秒。


 
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