Tris-Tricine-PAGE凝膠制備及電泳試劑盒（適用于多肽電泳）     說明書Ver 740056

 

 

● 產(chǎn)品組成：

● 產(chǎn)品簡介：

該產(chǎn)品含有多肽電泳全套試劑，可以用來檢測2.5-20 kD的多肽大小。本試劑盒可配制至少25塊常規(guī)大?。?×10cm）,厚度1 mm的PAGE膠。該產(chǎn)品具有以下特點(diǎn)：

1 分辨率高：凝膠緩沖液獨(dú)特配方，可以有效分離2.5-5 kD多肽；

2 使用方便：配制凝膠時(shí)只需1:1混合濃縮膠或分離膠溶液，不用計(jì)算；

3 易于上樣：紅色濃縮膠，易于觀察加樣孔，上樣方便。

● 貯存、運(yùn)輸及效期：

按照標(biāo)簽溫度貯存；常溫運(yùn)輸；有效期一年。

● 使用說明：

一. 10%APS溶液配制：

10% APS為固體粉末，使用前加入5 ml雙蒸水溶解即配制成10% APS溶液，將溶液分裝后置于-20℃保存，通常一年內(nèi)有效。該溶液在4℃條件下可以穩(wěn)定保存兩周。若發(fā)現(xiàn)凝膠聚合時(shí)間延長，應(yīng)考慮更換使用-20℃保存的10% APS溶液。

二. 制膠：

1. 配制分離膠:

1.1按照表一將不同體積的成分加入到小燒杯中混合；立即混勻5-10秒，以使溶液充分混勻。                    表1 （一塊1 mmmini膠用量）*

注： * 如非必須，不要使用厚度1.5 mm的凝膠，盡量使用厚度1 mm的凝膠，這樣會減少電泳后染色和脫色的時(shí)間。

1.2 在玻璃板中迅速灌入適量分離膠溶液，使液面和短玻璃板上沿之間的距離比梳齒長0.5 cm即可。注：此溶液為過量，請勿全部注入。

1.3 然后在分離膠溶液上輕輕覆蓋一層1-2 cm的無水乙醇層，使凝膠表面保持平整。

1.4 靜置10-30分鐘，待分離膠和乙醇層之間出現(xiàn)一個(gè)清晰的界面表示凝膠已聚合。

注：凝膠的聚合時(shí)間與環(huán)境溫度有關(guān)。夏天溫度較高時(shí)，聚合較快；冬天氣溫低時(shí)，聚合時(shí)間會延長?？梢愿鶕?jù)表1的標(biāo)準(zhǔn)條件調(diào)節(jié)促凝劑的加入量。分離膠25℃條件下，約20分鐘可以聚合。

2. 配制濃縮膠:

去除覆蓋在分離膠上的乙醇層，用濾紙將殘留的乙醇吸去。

2.1 按照表一將不同成分加入到小燒杯中混合；立即混勻5-10秒，以使溶液充分混勻。

2.2 將梳子插入凝膠內(nèi)，避免產(chǎn)生氣泡。

2.3 靜置30-50分鐘待凝膠聚合。

注：凝膠的聚合時(shí)間與環(huán)境溫度有關(guān)。夏天溫度較高時(shí)，聚合較快；冬天氣溫低時(shí)，聚合時(shí)間會延長?？梢愿鶕?jù)表1的標(biāo)準(zhǔn)條件調(diào)節(jié)促凝劑的加入量。濃縮膠25℃條件下，約40分鐘可以聚合。

三. 電泳：

3.1 變性電泳緩沖液和樣品配制：

3.1.1 10×Tris-Tricine- SDS緩沖液配制：

將10×Tris-Tricine -SDS緩沖液（10×TTS）粉末（Cat No：CB010P）置于一干凈的燒杯中，加入500 ml超純水，徹底攪拌混勻，不要調(diào)節(jié)pH，即配成500ml 10×TTS緩沖液。超純水稀釋10倍配成1×Tris-Tricine -SDS緩沖液。

注：伯樂Mini III電泳槽一次電泳使用300-350 ml 1×TTS緩沖液。

3.1.2 變性樣品處理：

        待上樣的檢測樣品與2×Tricine上樣緩沖液（變性，還原）[Cat No：TP050]等體積混合，95℃處理5分鐘后上樣。蛋白Marker一般已經(jīng)含有上樣緩沖液，根據(jù)說明書上樣（預(yù)染Marker不能加熱處理，非預(yù)染Marker上樣前一般要95℃處理5分鐘）。

3.2 非變性電泳緩沖液配制和樣品配制：

3.2.1 10×Tris-Tricine緩沖液配制：

將10×Tris-Tricine緩沖液（10×TT）粉末[Cat No:CB020P]（試劑盒不提供）置于一干凈的燒杯中，加入500 ml超純水，徹底攪拌混勻，不要調(diào)節(jié)pH，即配成500 ml 10×TT緩沖液。超純水稀釋10倍配成1×Tris-Tricine緩沖液。

注：伯樂Mini III電泳槽一次電泳使用300-350 ml 1×TT緩沖液。

3.2.2 非變性樣品處理：

      待上樣的檢測樣品與2×Tricine上樣緩沖液（非變性，非還原）[Cat No:TP070] （試劑盒不提供）等體積混合，不要加熱，直接上樣。

3.3 電泳：

將電泳槽的內(nèi)槽加滿電泳緩沖液，輕柔拔出梳子，用1 ml移液器將梳孔吹洗干凈，將Marker或蛋白樣品加入點(diǎn)樣孔，穩(wěn)壓電泳（表2），至藍(lán)色考馬斯亮藍(lán)指示前沿至分離膠下沿位置時(shí)即可停止電泳。整個(gè)電泳過程大約需要2.5-3個(gè)小時(shí)。

表2 多肽電泳條件

注：穩(wěn)壓電泳，電流不用調(diào)節(jié)，記錄電流數(shù)值在推薦范圍內(nèi)，電泳過程中電流會逐漸降低。

 

四. 染色：

凝膠可以使用常規(guī)考馬斯亮藍(lán)染色液和脫色液進(jìn)行染色和觀察。需要注意的是，常規(guī)染色和脫色方法需要較長時(shí)間，小肽由于長度較短，和凝膠結(jié)合不緊密，長時(shí)間在溶液中浸泡容易從凝膠中脫離。常規(guī)染色和脫色時(shí)效果不好或考慮其毒性，請選擇本公司的FastBlue蛋白染色液（Cat No：RTD6202），該產(chǎn)品除具有染色快，無毒，靈敏性高等特點(diǎn)外，還能對小肽在染色中起到固定作用，不至于小肽在染色和脫色中從凝膠中脫離，是常規(guī)染色液的理想替代品。

 實(shí)驗(yàn)示例：

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