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2×GC buffer

2×GC buffer

產(chǎn)品編號:RTB3101-01

產(chǎn)品規(guī)格:1ml

相關(guān)規(guī)格:
數(shù)量
價格 ¥0

2×GC Buffer

     產(chǎn)品組成:

目錄號

規(guī)格

價格

RTB3101-01

1ml





RTB3101-03

10×1ml

300

保存:-20

用途:

PCR 擴(kuò)增復(fù)雜結(jié)構(gòu)的 DNA 片段。

產(chǎn)品說明和注意事項(xiàng):

1. 本產(chǎn)品能與各種PCR酶配合使用,能夠擴(kuò)增具有復(fù)雜二級結(jié)構(gòu)模板(GC rich、重復(fù)序列等)的PCR片段。

2. 使用 GC Buffer 進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增時,建議使用 Tm 值較高的引物。因此,引物最好設(shè)計在 30 mer 左右。

3. 使用 GC Buffer擴(kuò)增的 GC rich DNA 片段長度,會因 GC 含量不同而各有差異。

4. 由于 GC Buffer 和一般的PCR Buffer 相比 DNA 變性效果較強(qiáng),因此,一般的 DNA片段(GC含量低于50%的目的片段)不推薦使用2×GC buffer進(jìn)行擴(kuò)增。

使用說明:

1. 按照下表在0.2ml PCR管中制備反應(yīng)體系:

 

成分

25μl反應(yīng)體系

50μl反應(yīng)體系

終濃度

Template

0.05-0.5 μg

0.1-1 μg

as you wish

Primer 110 μM

0.5 μl

1 μl

200nM

Primer 210 μM

0.5 μl

1 μl

200nM

2×GC buffer

12.5 μl

25 μl

dNTP Mixture(10 mM)

0.5 μl

1 μl

200μM each

Taq (5 U/μl)

0.25-0.5 μl

0.5-1 μl

2.5-5U

ddH2O

up to 25 μl

up to 50 μl

-

2. 混勻后,離心快甩將反應(yīng)液收集到管底。

3. PCR儀如果沒有熱蓋加熱的話,補(bǔ)加25μl礦物油。

4. PCR儀上執(zhí)行以下程序:

兩步法:

步驟

溫度

時間

循環(huán)數(shù)

初始變性

94

5 min

1

變性

94

30 sec

25-40*

退火和延伸

68

1 min/kb

最后延伸

72

5 min

1

*注: PCR 反應(yīng)條件視模板、引物等的結(jié)構(gòu)條件不同而各異。在實(shí)際操作中需根據(jù)模板、目的片段的大小、堿基序列和引物的長短等具體情況,設(shè)定最佳的反應(yīng)條件(溫度、時間等)。



1. 怎樣確定擴(kuò)增片段的GC含量大???

   推薦使用Oligo軟件分析片段的GC含量(如下圖所示)。

 

2. 2×GC buffer能擴(kuò)增正常GC含量片段嗎?

2×GC buffer可以擴(kuò)增GC含量正常的模板。然而,由于GC buffer有比較強(qiáng)的變性效果,因此一般的模板使用GC buffer擴(kuò)增時,有時會降低擴(kuò)增效率。

3. 2×GC buffer能兼容大多數(shù)PCR用酶嗎?

2×GC buffer能兼容大多數(shù)PCR酶,比如Taq,Taq plusLong Taq等,可以根據(jù)片段長度以及保真性要求選擇不同的酶。

4. 使用GC buffer擴(kuò)增時,為什么推薦使用兩步法?

由于目的片段GC含量高,引物的Tm值往往會比較高,在PCR時,當(dāng)退火溫度和延伸溫度差距較小時,比如退火溫度超過60時,退火溫度和延伸溫度可以設(shè)成同一數(shù)值,一般為68。





2×GC buffer
lane 1-5: Rice 390bp fragement(GC% 77.1%)
lane 6-10: Rice 760bp fragement(GC% 72.9%)
lane 1 and 6: TaKaRa 2×GC buffer I
lane 2 and 7: TaKaRa 2×GC buffer II
lane 3 and 8: RTB3101 2×GC buffer
lane 4 and 9: RTB3106 10×Taq PCR buffer
lane 5: Rice 390bp,RTB3101 2×GC buffer, 三步法擴(kuò)增
lane 10: Rice 760bp,RTB3101 2×GC buffer, 三步法擴(kuò)增




 
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