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高分子量蛋白(大于150 kD)Western Blot攻略

高分子量蛋白(大于150 kDWestern Blot攻略

注:該文引自基因幫公眾號(hào)天才試劑君文章,略有修改。  Ver.730875

選對(duì)凝膠很重要

三種最常見的凝膠系統(tǒng)包括Tris-Glycine, Bis-Tris and Tris-Acetate系統(tǒng)。

Tris-Glycine凝膠的pH8.6,且保質(zhì)期很短,一般4-8℃保存有效期一個(gè)月。在跑膠的過程中,凝膠系統(tǒng)的pH還有上升的趨勢(shì),可達(dá)到9.5,這會(huì)導(dǎo)致蛋白降解和低分辨率。

Bis-Tris凝膠的pH~6.5,相對(duì)Tris-Glycine凝膠,穩(wěn)定性和保質(zhì)期都有所增加,4-8℃貯存可以保存一年。但這種凝膠更適合于低分子量電泳分離(低于200 kD),不適合高分子量蛋白電泳。

Tris-Acetate 凝膠的pH~7,跑大分子蛋白會(huì)呈現(xiàn)很高的分辨率,同時(shí)4-8℃貯存可以保存一年。

所以跑大分子蛋白時(shí),我們推薦使用Tris-Acetate 凝膠(貨號(hào):RTD6162;RTD6155)。

凝膠濃度很重要

既然選擇了Tris-Acetate 凝膠,要考慮凝膠濃度的問題。凝膠濃度與孔徑成反比:濃度越小,孔越大,較大的蛋白質(zhì)更容易通過較大的孔,所以建議使用低百分比的Tris醋酸凝膠(貨號(hào):RTD6162),如6%等度膠。也可以使用梯度凝膠,但是制作梯度凝膠會(huì)恨棘手,需要一個(gè)梯度凝膠生成系統(tǒng)(貨號(hào):RT-GZY02),不過現(xiàn)在很多公司都會(huì)出售具有不同范圍的梯度預(yù)制膠(貨號(hào):RTD6155),節(jié)省時(shí)間。

電泳內(nèi)槽緩沖液需要添加抗氧化劑

Tris-醋酸電泳使用10×Tris-醋酸-SDS電泳緩沖液(貨號(hào):TA050),經(jīng)典的Tris-甘氨酸-SDS電泳緩沖液無法兼容使用。由于DTTpH中性時(shí),基本不隨著樣品泳動(dòng),為保證蛋白樣品在電泳中維持還原力,Tris-Acetate 凝膠電泳時(shí),電泳槽內(nèi)槽緩沖液需要添加抗氧化劑(貨號(hào):TA1510),這樣可以保證整個(gè)電泳過程中蛋白的變性還原狀態(tài),提高樣品的分辨率。

● 四 提高轉(zhuǎn)膜緩沖液中的SDS,減少甲醇

高分子量蛋白轉(zhuǎn)膜緩沖液中的組成至關(guān)重要。如果有甲醇存在,大分子蛋白很容易沉淀,可以通過減少轉(zhuǎn)膜緩沖液中的甲醇百分比(10%或更低)來避免這種情況發(fā)生。為了進(jìn)一步確保蛋白質(zhì)不會(huì)沉淀,考慮在轉(zhuǎn)膜緩沖液中添加SDS至終濃度為0.05%-0.1%。SDS向蛋白添加均勻的負(fù)電荷,使得它們更容易從凝膠轉(zhuǎn)移到膜上。高分子量蛋白的轉(zhuǎn)膜緩沖液可以選擇10×Tris-醋酸轉(zhuǎn)膜緩沖液(濕轉(zhuǎn),粉末型)(貨號(hào):TA5030P

● 五 選擇合適的轉(zhuǎn)印膜

轉(zhuǎn)印膜一般有PVDF膜或NC膜,跑大分子蛋白建議選擇PVDF膜。如前面所說,如果有甲醇存在,大分子蛋白很容易沉淀。而PVDF膜可以不需要在轉(zhuǎn)膜緩沖液中添加甲醇,目的蛋白轉(zhuǎn)印的機(jī)會(huì)更高。PVDF膜有各種孔徑尺寸,最常見的是0.22 μm和0.45 μm。與凝膠一樣,較大的蛋白比較小的蛋白更容易穿過大孔隙。高分子量蛋白質(zhì)可以用0.45μm膜(貨號(hào):ML-PV-131545-5)轉(zhuǎn)移,避免使用0.22 μm孔徑。

● 六 增加轉(zhuǎn)印時(shí)間

在正確的選擇完凝膠、轉(zhuǎn)印膜及轉(zhuǎn)移緩沖液后,轉(zhuǎn)印正式開始。半干轉(zhuǎn)快且方便,但不適用于大分子蛋白。大分子蛋白建議濕轉(zhuǎn),因?yàn)榇蠓肿拥鞍邹D(zhuǎn)移時(shí)間很慢,推薦350-400 mA轉(zhuǎn)移90 min 4℃,40 mA,轉(zhuǎn)印過夜。

● 七 關(guān)于轉(zhuǎn)印膜封閉

沒有任何一種封閉試劑能通用于蛋白封閉。BSA通常作為NC膜的封閉液,但是對(duì)于PVDF膜,它的封閉效果并不是最好。大蛋白轉(zhuǎn)膜后的封閉可以選擇5%脫脂奶粉(貨號(hào):WN1070)。

另外,不要讓PVDF膜在檢測(cè)過程中的任何時(shí)間點(diǎn)干透,如果膜部分變干,可以讓膜完全干掉,然后用甲醇重新潤(rùn)濕,之后用緩沖液浸泡,繼續(xù)操作。

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