TMB顯色液(沉淀型，組化或膜HRP顯色用)

TMB Color Development Solution for IHC or Blotting

●       產(chǎn)品簡(jiǎn)介：

TMB，即 3, 3′,5 ,5′-Tetramethylbenzidine，是辣根過(guò)氧化物酶（HRP）的常用底物。在辣根過(guò)氧化物酶或其他適當(dāng)過(guò)氧化物酶的催化下，TMB 會(huì)產(chǎn)生藍(lán)色產(chǎn)物。TMB 顯色液（沉淀型，組化或膜HRP顯色用，TMB Color Development Solution for IHC or Blotting）采用最新的單一溶液的 TMB 顯色技術(shù)，用于 Western 或免疫組化等 HRP的顯色檢測(cè)，簡(jiǎn)化了操作步驟，并且使檢測(cè)結(jié)果更加穩(wěn)定可靠。本顯色液具有高靈敏性，與 HRP反應(yīng)后產(chǎn)生藍(lán)紫色沉淀，沉淀吸附于印跡膜上，不會(huì)脫落，方便顯色結(jié)果的保存和觀察。

? 本試劑盒主要適用于免疫組化或原位雜交時(shí)HRP的顯色檢測(cè)，以及Western、Southern、Northern等HRP的膜顯色檢測(cè)；本顯色液也可以用于原位檢測(cè)細(xì)胞或組織內(nèi)源性的過(guò)氧化物酶。由于產(chǎn)生的是沉淀型藍(lán)色產(chǎn)物，不適用于ELISA檢測(cè)。

? 用于免疫組化檢測(cè)時(shí)，如果每個(gè)樣品的顯色液用量為0.1ml，則可以檢測(cè)1000個(gè)樣品；對(duì)于膜的顯色檢測(cè)，如果每次使用2.5 ml顯色液，則可以檢測(cè)40次。

● 保存條件：

2-8℃避光保存；一年有效。

● 使用說(shuō)明：

? 如果發(fā)現(xiàn)TMB顯色液出現(xiàn)混濁或顏色變成藍(lán)色，應(yīng)該停止使用。

一. 免疫組化檢測(cè)：

1. 參考免疫組化的實(shí)驗(yàn)步驟，在與辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗體孵育后，用適當(dāng)洗滌液洗滌3-5次，每次3-5分鐘。

2. 洗滌完畢后，去除洗滌液，滴加約100微升TMB顯色液。

3. 室溫避光孵育3-30分鐘或更長(zhǎng)時(shí)間(可在濕盒中顯色過(guò)夜)，直至顯色至預(yù)期深淺。

4. 去除染色液，加入重蒸水孵育10分鐘以終止反應(yīng)。

5. 拍照記錄或適當(dāng)封片后拍照記錄。如果有必要，可以使用中性紅染色液進(jìn)行復(fù)染后再進(jìn)行拍照記錄或適當(dāng)封片后拍照記錄。

二. 膜的HRP顯色檢測(cè)：

1. 參考相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)步驟，在與辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗體孵育后，用適當(dāng)洗滌液洗滌3-5次，每次5分鐘左右。

2. 洗滌完畢后，去除洗滌液，

3. 滴加約適量TMB顯色液充分覆蓋膜。

4. 室溫避光孵育3-30分鐘或更長(zhǎng)時(shí)間(可長(zhǎng)達(dá)數(shù)小時(shí))，直至顯色至預(yù)期深淺。

5. 直接拍照記錄。

● 常見(jiàn)問(wèn)題：

一. 背景顯色太深。

1. 如果背景顯色太深，一方面需考慮使用適當(dāng)?shù)姆忾]液進(jìn)行封閉，例如選購(gòu)適當(dāng)?shù)姆忾]液或使用和一抗相同來(lái)源的血清(10%)進(jìn)行封閉。另一方面，請(qǐng)選購(gòu)經(jīng)過(guò)適當(dāng)吸附的二抗，以減小二抗的非特異性吸附。

2. 可以考慮縮短顯色時(shí)間，或降低二抗?jié)舛?。另外，選擇適當(dāng)強(qiáng)度的洗滌液，或延長(zhǎng)洗滌時(shí)間也會(huì)有所幫助。

二. 沒(méi)有顯色或顯色太弱。

 1. 適當(dāng)提高一抗或二抗的濃度。在離心管內(nèi)用稀釋的二抗與染色液反應(yīng)，檢測(cè)二抗是否可以被正常顯色。 

2. 可以考慮使用更加靈敏的放大檢測(cè)體系，例如使用生物素檢測(cè)體系。

3. 可以適當(dāng)延長(zhǎng)顯色時(shí)間。

4. 如果上述改進(jìn)不能獲得預(yù)期效果，對(duì)于免疫組化或Western，可以考慮更換效果更好的一抗；對(duì)于Southern、Northern或原位雜交，則可以考慮更換探針。

實(shí)驗(yàn)示例：

樣品：K562細(xì)胞,SDS裂解液(Cat:RL1060)提取總蛋白；
電泳：4-20%RealPAGE Tris-Glycine預(yù)制膠(Cat:RTD6117-0420)
轉(zhuǎn)膜：RealBlot快速轉(zhuǎn)膜液(Cat:RT5020),0.45μmPVDF膜，400 mA 30 min
封閉：Western封閉液I（BSA）（Cat：WB1070）常溫封閉60min
一抗：Anti-PCNA抗體（鼠單抗）（Cat：APM5012） 1:5000  RT 60min；
二抗：HRP標(biāo)記羊抗鼠IgG（Cat：HGM1060） 1:5000  RT 60min；
顯色：TMB顯色液(沉淀型，組化或膜HRP顯色用)（Cat：TM1026），顯色1分鐘

使用TMB顯色液發(fā)表部分文章列表：

1. [2022 IF=9.22] A HCR based multivalent aptamer amplifier for ultrasensitive detection of Salmonella.

Author: Mengni Sun, Na Ma, Hanxing Shi, Ling-Zhi Cheong, Wenge Yang, Zhaohui Qiao

Product: TM1026 TMB顯色液(沉淀型，組化或膜HRP顯色用)

Journal: Sensors and Actuators:B.Chemical  2023,375,132860

Institution：College of Food and Pharmaceutical Sciences, Ningbo University

Paper link：https://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0925400522015039