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植物葉綠體提取試劑盒(大量樣品)

植物葉綠體提取試劑盒(大量樣品)

產(chǎn)品編號(hào):RTU5001

產(chǎn)品規(guī)格:10次

數(shù)量
價(jià)格 ¥800


植物葉綠體提取試劑盒        

產(chǎn)品編號(hào)

產(chǎn)品名稱

包裝

RTU5001

植物葉綠體提取試劑盒

10

產(chǎn)品簡(jiǎn)介:

葉綠體(Chloroplast)是質(zhì)體的一種, 是高等植物和一些藻類所特有的能量轉(zhuǎn)換器,是光合作用的反應(yīng)場(chǎng)所。在高等植物中葉綠體為雙凸或平凸透鏡,長徑5~10μm,短徑2~4μm,厚2~3μm。高等植物的葉肉細(xì)胞一般含50~200個(gè)葉綠體,可占細(xì)胞質(zhì)的40%,葉綠體的數(shù)目因物種細(xì)胞類型,生態(tài)環(huán)境,生理狀態(tài)而有所不同。葉綠體由葉綠體外被(chloroplast envelope)、類囊體(thylakoid)和基質(zhì)(stroma)三部分組成,含有3種不同的膜:外膜、內(nèi)膜、類囊體膜和3種彼此分開的腔:膜間隙、基質(zhì)和類囊體腔。本公司的植物葉綠體提取試劑盒采用密度梯度離心方法,可以從多種植物中提取高純度的葉綠體。

1. 即用型試劑盒,用戶不需要單獨(dú)配制各種溶液。

2. 試劑盒可以用于葉綠體粗提,所得葉綠體含少量其他細(xì)胞器污染,可用于后續(xù)的SDS-PAGE,Western,ELSIA和蛋白組分析。也可以用于葉綠體精提,所得葉綠體完整,可用于后續(xù)的光合作用,電子鏈和磷酸化,跨膜轉(zhuǎn)運(yùn),體外葉綠體蛋白合成,蛋白定位等研究。還可用于葉綠體膜,基質(zhì),類囊體的提取以及葉綠體DNA和葉綠體RNA純化。

3. 以每次處理30 g葉片計(jì)算,本產(chǎn)品可使用8-10次提取,每次能得到3-5 mg左右葉綠體。

4. 已經(jīng)成功用于擬南芥,綠蘿,菠菜,大豆,萵筍,白菜,煙草和甜菜等植物,還可用于更多植物(可能需要優(yōu)化條件)。

貯存及運(yùn)輸:

4-8℃保存,至少一年有效;試劑盒常溫運(yùn)輸。

產(chǎn)品組成:

產(chǎn)品貨號(hào)

產(chǎn)品名稱

包裝

貯存

RTU5001-01

葉綠體提取緩沖液(

2×250 ml

4-8

RTU5001-02

密度梯度分離試劑

65 ml

4-8

RTU5001-03

BSA

3 g

4-8

RTU5001-04

1 M DTT(粉末裝)

2.5 ml

4-8

配制后-20℃貯存

RTU5001-05

過濾紙

50/

RT

 

說明書

一份

-

使用說明:

注意:葉綠體對(duì)溫度高度敏感,所以整個(gè)操作必須在冰上或者在冷室進(jìn)行,所用器皿和溶液均需要在4℃預(yù)冷。離心時(shí)一定要在4℃進(jìn)行,離心力以g而不是rpm計(jì)算。如果需要研究葉綠體的功能,提取過程還需要在昏暗的光線條件下進(jìn)行。

需要自備材料:

剪刀;50 ml尖底或圓底離心管;15 ml尖底或圓底離心管;漏斗;勻漿機(jī);低溫離心機(jī)。

1.1 材料預(yù)處理:

實(shí)驗(yàn)前1-2天將植物放在暗室培養(yǎng)以減少葉綠體中淀粉顆粒的形成,否則離心時(shí)這些顆粒很容易使葉綠體破裂。葉片在實(shí)驗(yàn)前需先用自來水洗凈,再用蒸餾水淋洗,去掉多余水分。如果葉片采集后不能立即處理,則保存時(shí)需要保持葉片濕潤,即使如此,葉片采集后的放置時(shí)間也不能超過一天。

1.2  1×葉綠體提取緩沖液(即用型)配制:

 

葉綠體提取緩沖液(即用型)

配制量200 ml

葉綠體提取緩沖液(

40 ml

BSA

0.2 g

1 M DTT

200 μl

滅菌水

定容至200 ml

 

冰上預(yù)冷待用,現(xiàn)用現(xiàn)配,不建議貯存

注:一個(gè)30克樣品提取反應(yīng)需要 150 ml 1×葉綠體提取緩沖液(即用型)。

1.3 葉片勻漿:

1.3.1 新鮮采集植物葉片,快速去除葉脈(約30克)并將葉片剪成1-3 cm2大小的碎片并浸泡在150 ml的預(yù)冷的1×葉綠體提取緩沖液(即用型)中(每克葉片加5 ml)。

1.3.2 將浸泡了葉片的溶液轉(zhuǎn)移到勻漿機(jī)(貨號(hào):RT-2243A)中,低速勻漿10秒,避免起泡沫。用玻璃棒把液面的碎片按入勻漿機(jī)底部后,再低速勻漿10秒,重復(fù)10秒勻漿3-4次至葉片破碎即可,不要過分勻漿,否則會(huì)降低完整葉綠體的得率。

1.3.3 2層過濾紙置于小漏斗上,將勻漿液過濾收集到預(yù)冷的250 ml量筒中,一般更換三次濾紙可收集約120 ml濾液,將濾液等分到4個(gè)預(yù)冷的50 ml的塑料離心管中(每個(gè)管中的濾液不要超過35 ml)。

1.4  離心去雜質(zhì):

4 200 g離心5分鐘,沉淀為未破裂植物組織、細(xì)胞或細(xì)胞核,如果樣品中淀粉含量較高,沉淀可能為白色。(右圖)

注:此步驟用低速離心去除雜質(zhì),不能省略,否則提取的葉綠體會(huì)有其他細(xì)胞器的污染。

1.5 收集葉綠體粗提液:

1.5.1將步驟1.4得到的上清液平分到4個(gè)預(yù)冷的50 ml塑料離心管中。

1.5.2 4 1100 g離心15分鐘,小心棄上清,沉淀含葉綠體,呈深綠色(右圖)。

1.5.3 在沉淀中加入1.5 ml 預(yù)冷的1×葉綠體提取緩沖液(即用型),手彈離心管底部使葉綠體重懸,收集4管溶液(約6 ml),此溶液即為葉綠體粗提產(chǎn)物(含有破碎的葉綠體和完整的葉綠體),可直接用于后續(xù)的SDS-PAGEWestern,蛋白組分析。

注:重懸時(shí)最好避免溶液起泡,手指輕彈,不要用槍頭吹打,否則葉綠體容易破裂。

1.6 完整葉綠體的純化:

葉綠體重懸液配制

 

葉綠體重懸液

 

配制量20 ml

葉綠體提取緩沖液(

4 ml

滅菌水

16 ml

 

冰上預(yù)冷待用,現(xiàn)用現(xiàn)配,不建議貯存

1.6.1 單梯度分離法(適合菠菜,白菜,萵苣,擬南芥,綠蘿等):

1.6.1.1 40%密度梯度液配制-10 ml

15 ml離心管中加入6 ml 1×葉綠體提取緩沖液(即用型)和4 ml密度梯度分離試劑,充分混合均勻,得40%密度梯度液,冰浴備用。

1.6.1.210 ml 40%密度梯度液平分到2個(gè) 15 ml離心管中,每管5 ml;將步驟1.5.3得到的葉綠體粗提液3 ml小心鋪在5 ml密度梯度液之上;另一管重復(fù)。(5 ml 40%密度梯度液用可以分離3 ml 葉綠體粗提液,其他體積以此比例換算)。

1.6.1.3  43200 g離心15分鐘,綠色沉淀為完整葉綠體(右圖)。

注:如果最上層的分離試劑不夠清亮,可以延長離心20分鐘。

1.6.1.4 小心棄上清,保留沉淀,每管沉淀中加入1 ml 葉綠體重懸液,輕柔重懸,可以收集到2 ml完整葉綠體溶液。

1.6.2雙梯度分離法(適合煙草,甜菜,豌豆等):

1.6.2.1 80%密度梯度重液配制-4 ml

15 ml離心管中加入0.8 ml 1×葉綠體提取緩沖液(即用型)和3.2 ml 密度梯度分離試劑,充分混合均勻,得80%密度梯度重液。

1.6.2.2 40%密度梯度輕液配制-8 ml

在另一15 ml離心管加入4.8 ml 1×葉綠體提取緩沖液(即用型)和3.2 ml 密度梯度分離試劑,充分混合均勻,得40%密度梯度輕液。

1.6.2.3 取一只15 ml離心管,加入1.86 ml 80%密度梯度重液,隨后取3.74 ml 40%密度梯度輕液小心鋪在80%密度梯度重液之上,冰浴備用;然后取步驟1.5.3得到的3 ml葉綠體粗提液小心鋪在密度梯度輕液之上。另一管重復(fù)。

注:每5.6 ml 40%/80%密度梯度液可以分離3 ml 葉綠體粗提液;其他體積按照比例調(diào)整。

1.6.2.4 4 3200 g離心15分鐘,上層綠色帶含破碎的葉綠體、線粒體和核糖體等,重液和輕液間的綠色帶為完整葉綠體(右圖)。

注:如果最上層的分離試劑不夠清亮,可以延長離心20分鐘。

1.6.2.5 重懸葉綠體:

用廣口吸管小心將重液和輕液之間的綠色帶(完整葉綠體)轉(zhuǎn)移到新的15 ml離心管中,加入三倍體積預(yù)冷的葉綠體重懸液,輕柔混勻。

1.6.2.6 離心收集葉綠體:

4 1750 g離心6分鐘,小心將上清倒出后,在綠色的葉綠體沉淀中加入預(yù)冷的0.5 ml葉綠體重懸液,手指輕彈管底使葉綠體重懸。最終可以收集到1 ml完整葉綠體溶液。

1.7 葉綠體貯存:

葉綠體可在顯微鏡下檢查葉綠體完整性。葉綠體重懸液避光-80℃保存。葉綠體必須盡快使用,否則非常容易失去活性。所得精提葉綠體可用于后續(xù)的光合作用,電子鏈和磷酸化,跨膜轉(zhuǎn)運(yùn),體外葉綠體蛋白合成,蛋白定位等研究。還可用于葉綠體膜,基質(zhì),類囊體提取以及葉綠體DNA和葉綠體RNA純化實(shí)驗(yàn)等。

1.8 葉綠素含量測(cè)定:

通常葉綠體含量用單位葉綠素含量來表示,即x mg 葉綠素/ml 葉綠體懸浮液。

1.8.1 取10 μl 葉綠體懸浮液加入到990 μl 80%丙酮溶液中,混勻。

1.8.2 3000 g 離心5分鐘,取上清測(cè)定OD652 吸光值,用80%丙酮做空白對(duì)照。

1.8.3 根據(jù)以下公式計(jì)算葉綠素:

葉綠素濃度(mg/ml)=(OD652×100)/36

100:稀釋倍數(shù)

36:extinction coefficient in ml/cm·mg

1.9 實(shí)驗(yàn)示例:

30克綠蘿葉片,加入150 ml 1×葉綠體提取緩沖液(即用型)勻漿5×10秒,3次過濾共收集120 ml過濾液,平分4管,4℃ 1100 g 離心15 min,棄上清,每管重懸于1.5 ml 1×葉綠體提取緩沖液(即用型)中,共得到6 ml 葉綠體粗提液。2×3 ml 粗提液平鋪于2×5 ml 40%密度梯度液之上,4 3200 g離心15分鐘,棄上清,每管沉淀重懸于1 ml 葉綠體重懸液中,共得到2 ml精制葉綠體重懸液,測(cè)定葉綠素含量為3.43 mg/ml重懸液。30克葉片提取得到6.86 mg葉綠體。取10 μl葉綠體溶液稀釋20倍,取50 μl稀釋液顯微鏡40倍物鏡觀察,如右圖。


RTU5001 植物葉綠體提取試劑盒發(fā)表文章列表

1. [2022 IF=7.2] Sufficient potassium improves inorganic phosphate-limited photosynthesis in Brassica napus by enhancing metabolic P fractions and Rubisco activity.

實(shí)驗(yàn)植物:油菜

Author: Jinyao Yan, Xiaolei Ye, Yi Song, Tao Ren, Chongming Wang, Xiaokun Li, Rihuan Cong, Zhifeng Lu,Jianwei Lu.

Journal: The Plant Journal (2023) 113, 416–429

Institution  Huazhong Agricultural University

Paper link https://doi.org/10.1111/tpj.16057


 
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