T4連接酶
T4 DNA ligase
貨號(hào)：RTT2101
● 產(chǎn)品組成：
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名稱(chēng)
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規(guī)格
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T4 DNA ligase (5U/μl)
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100 U (20μl)
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10×T4 DNA Ligation Buffer
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0.2 ml
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50%PEG Solution
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0.15 ml
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● 保存：-20℃
● 產(chǎn)品簡(jiǎn)介：
T4 DNA
Ligase 是從表達(dá)T4
DNA Ligase 基因的大腸桿菌經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)后分離純化而來(lái)的，催化相鄰DNA鏈的5’磷酸基團(tuán)和3’羥基基團(tuán)以磷酸二酯鍵結(jié)合反應(yīng)。該酶可催化平末端或粘性末端DNA之間的連接，還可修復(fù)雙鏈DNA、RNA、DNA/RNA雜交雙鏈中的單鏈切口。本品可應(yīng)用于DNA插入片段和載體DNA的粘性末端和平末端的連接，以及線性DNA的自身環(huán)化。
活性定義：此酶的活力單位為Weiss Unit。1個(gè)Weiss
Unit相當(dāng)于約200個(gè)粘性末端連接單位（cohesive-end
ligation unit, CEU）。1個(gè)CEU單位定義為在20 μl的連接反應(yīng)體系中，在16℃30分鐘內(nèi)，能使50%的經(jīng)HindIII消化的λDNA片段連接所需的酶量。
● 注意事項(xiàng)
1．T4
DNA Ligase的最終用量不要超過(guò)推薦的用量，否則影響連接效率。
2．PEG可以極大提高平末端的連接效率，我們推薦加入終濃度為5%
PEG Solution以提高平末端的連接效率。
3．為了提高轉(zhuǎn)化效率，轉(zhuǎn)化時(shí)建議所加入連接產(chǎn)物的量不要超過(guò)感受態(tài)細(xì)胞體積的10%。
4．由于T4
DNA Ligase中含有甘油，比較粘稠容易掛壁，建議使用前短暫離心將液體收集到管底，取樣時(shí)槍頭盡量不要深入液面太深以免粘在槍頭上造成損失。
● 使用方法：
一
DNA片段和載體DNA的連接
1）粘性末端的連接
1．反應(yīng)體系:
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10μl體系
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終濃度
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線性載體DNA
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x μl
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10-50 ng
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插入DNA片段
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y μl
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插入片段：載體=1:1-5:1*
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10×ligation
buffer
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1 μl
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1×
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T4 DNA
ligase(5U/μl)
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0.1 μl
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0.5 U
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ddH2O
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up to 10 μl
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*：載體與插入片段的摩爾數(shù)比需要優(yōu)化：一般vector:insert在1:1~1:5之間均可得到較好的結(jié)果。用以下公式計(jì)算片段摩爾數(shù)：pmol數(shù)= DNA量(ng)/(660×片段bp數(shù))×1000。例如：插入片段2000bp，線性載體為3000bp，如果載體使用量為50ng（0.025pmol），10μl連接體系中vector:insert的摩爾比是1:3，則需要2000bp pmol數(shù)為0.075pmol，插入片段2000bp的使用量為100ng。
2．徹底輕柔混勻后，瞬間離心，將管壁上的溶液收集到管底。
3．反應(yīng)條件：16℃孵育30分鐘。
4．可取5
μl連接產(chǎn)物熱擊轉(zhuǎn)化50
μl感受態(tài)細(xì)胞或取1-2
μl連接產(chǎn)物電擊轉(zhuǎn)化50
μl感受態(tài)細(xì)胞。
注：1）若要提高電轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)效率，推薦65℃孵育10分鐘或70℃孵育5分鐘以滅活T4 DNA Ligase后，用DNA產(chǎn)物純化試劑盒對(duì)連接后的DNA片段進(jìn)行純化后進(jìn)行電擊轉(zhuǎn)化。
2）若要提高轉(zhuǎn)化子數(shù)目，可將連接時(shí)間延長(zhǎng)至1小時(shí)。
3）在10
μl連接體系中若T4連接酶的終濃度大于1
U，必須對(duì)連接后的DNA片段進(jìn)行純化后方可進(jìn)行電轉(zhuǎn)。
2）平末端的連接
1．反應(yīng)體系:
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10μl體系
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終濃度
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線性平末端載體DNA*
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x μl
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10-50 ng
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插入DNA片段
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y μl
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插入片段：載體=1:1-5:1**
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10×ligation
buffer
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1 μl
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1×
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T4 DNA
ligase(5U/μl)
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0.5 μl
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2.5 U
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50% PEG
solution
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1 μl
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5%
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ddH2O
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up to 10 μl
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*：平滑末端的載體與 DNA 片段進(jìn)行連接時(shí)，應(yīng)首先將載體進(jìn)行去磷酸化處理，以防止其自身環(huán)化。
**：載體與插入片段的摩爾數(shù)比需要優(yōu)化：一般vector:insert在1:1~1:5之間均可得到較好的結(jié)果。用以下公式計(jì)算片段摩爾數(shù)：pmol數(shù)= DNA量(ng)/(660×片段bp數(shù))×1000。例如：插入片段2000bp，線性載體為3000bp，如果載體使用量為50ng（0.025pmol），10μl連接體系中vector:insert的摩爾比是1:3，則需要2000bp pmol數(shù)為0.075pmol，插入片段2000bp的使用量為100ng。
2．徹底輕柔混勻后，瞬間離心，將管壁上的溶液收集到管底。
3．反應(yīng)條件：16℃孵育30分鐘。
4．可取5
μl連接產(chǎn)物熱擊轉(zhuǎn)化50
μl感受態(tài)細(xì)胞或取1-2
μl連接產(chǎn)物電擊轉(zhuǎn)化50
μl感受態(tài)細(xì)胞。
注：1）由于平末端連接體系中，T4 ligase用量較大，若要提高電轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)效率，推薦65℃孵育10分鐘或70℃孵育5分鐘以滅活T4
DNA Ligase后，用DNA產(chǎn)物純化試劑盒或氯仿抽提對(duì)連接后的DNA片段進(jìn)行純化后才能進(jìn)行電擊轉(zhuǎn)化。
2）若要提高轉(zhuǎn)化子數(shù)目，可將連接時(shí)間延長(zhǎng)至1小時(shí)。
二 線性DNA的自身環(huán)化
1．反應(yīng)體系:
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50μl體系
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終濃度
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線性載體DNA
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x μl
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10-50 ng
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10×ligation
buffer
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5 μl
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1×
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T4 DNA
ligase(5U/μl)
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1 μl
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5 U
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ddH2O
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up to 50 μl
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2．徹底輕柔混勻后，瞬間離心，將管壁上的溶液收集到管底。
3．反應(yīng)條件：16℃孵育30分鐘。
4．可取5
μl連接產(chǎn)物熱擊轉(zhuǎn)化50
μl感受態(tài)細(xì)胞或取1-2
μl連接產(chǎn)物電擊轉(zhuǎn)化50
μl感受態(tài)細(xì)胞。
注：1）若要提高電轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)效率，推薦65℃孵育10分鐘或70℃孵育5分鐘滅活T4 DNA Ligase后，用DNA產(chǎn)物純化試劑盒或氯仿抽提對(duì)連接后的DNA片段進(jìn)行純化后才能進(jìn)行電擊轉(zhuǎn)化。
三 接頭連接
1．反應(yīng)體系:
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20μl體系
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終濃度
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線性DNA
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x μl
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100-500 ng
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磷酸化接頭
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y μl
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1-2 μg
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10×ligation
buffer
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2 μl
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1×
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50% PEG
solution
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2 μl
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5%
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T4 DNA
ligase(5U/μl)
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0.4 μl
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2 U
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ddH2O
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up to 20 μl
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2．徹底輕柔混勻后，瞬間離心，將管壁上的溶液收集到管底。
3．反應(yīng)條件：16℃孵育30分鐘。
4．65℃孵育10分鐘或70℃孵育5分鐘滅活T4
DNA Ligase。連接產(chǎn)物可以直接進(jìn)行限制性內(nèi)切酶酶切反應(yīng)。