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免疫沉淀試劑盒(離心柱法)

免疫沉淀試劑盒(離心柱法)

產(chǎn)品編號:RTD9201

產(chǎn)品規(guī)格:20次

數(shù)量
價格 ¥700

免疫沉淀試劑盒(離心柱法)

貨號

名稱

規(guī)格

RTD9201

免疫沉淀試劑盒(離心柱法)

20

 ● 產(chǎn)品簡介:

免疫沉淀(Immunoprecipitation)是一種分子生物學(xué)技術(shù),用于通過特定抗體捕獲目標(biāo)抗原(蛋白質(zhì))。該產(chǎn)品使用小于10 μg的抗體即可高效地實現(xiàn)抗原免疫沉淀。首先將特異性抗體加入樣品中形成免疫復(fù)合物,然后將免疫復(fù)合物加到Protein A/G 瓊脂糖樹脂中形成Protein A/G-抗體-抗原復(fù)合物,洗滌該復(fù)合物以除去未結(jié)合的物質(zhì),再以變性洗脫緩沖液或低pH的酸性洗脫緩沖液將結(jié)合的免疫復(fù)合物從Protein A/G上洗脫。

該試劑盒包含確保抗原高產(chǎn)量的優(yōu)化緩沖液和高效離心柱和收集管,通過減少處理和混合時間簡化實驗步驟,能有效避免普通離心方法不易吸取上清的問題。 離心柱經(jīng)過優(yōu)化處理,可以使用少至20 μl的Protein A/G樹脂。

特別提示:試劑盒配套的IP裂解緩沖液含有溫和的去垢劑Triton X-100,可以有效提取胞漿蛋白和核蛋白。然而對于部分核蛋白(如與染色體緊密結(jié)合的核蛋白)以及膜蛋白(特別是多次跨膜蛋白)提取效果不好,不建議使用該試劑盒進(jìn)行免疫沉淀。

以每次使用20 μl Protein A/G 瓊脂糖樹脂計算,試劑盒可以進(jìn)行20次IP反應(yīng)。

● 產(chǎn)品組成:

貨號

名稱

規(guī)格

貯存

RTD9201-01

IP裂解緩沖液

25 ml

4

RTD9201-02

洗滌緩沖液

25 ml

4

RTD9201-03

Protein A/G 瓊脂糖樹脂

0.4 ml

4

RTD9201-04

酸性洗脫液

2 ml

4

RTD9201-05

中和緩沖液

0.2 ml

4

RTD9201-06

變性洗脫液

1 ml

-20

RTD9201-07

離心柱(含收集管)

20

RT

 

說明書

-

 

● 產(chǎn)品貯存、運輸及效期:

按照標(biāo)簽溫度貯存;常溫運輸;有效期一年。

● 用前必讀:

1. 除非另有說明,所有操作在 4℃下進(jìn)行。

2. 樹脂的所有離心步驟需在低速(如 1000×g)、1 min條件下操作。離心速度大于 5000× g 可能會導(dǎo)致樹脂聚集,難以重懸。

3. 離心柱離心過程中,使用2 ml離心管收集時流穿的液體體積應(yīng)不超過 600 μl,使用1.5 ml離心管

收集時則應(yīng)不超過 300 μl。體積超出可能導(dǎo)致柱內(nèi)產(chǎn)生回壓及洗滌和洗脫不完全。

4. 使用此試劑盒時抗體將與免疫沉淀的抗原一起被洗脫。因此,在還原型 SDS-PAGE 凝膠或 Western blot時至少產(chǎn)生三個蛋白條帶:抗體重鏈( ~50 kD) 、輕鏈(~25 kD )和抗原。如果抗體條帶掩蓋了免疫沉淀的抗原,則可用重鏈或輕鏈專一性IgG-HRP檢測目的蛋白,避免輕重鏈的干擾。

5. 為了優(yōu)化結(jié)果,盡量使用親和純化后的抗體。盡管也可使用血清,但血清樣品中針對目的抗原的特異性抗體含量可能僅占IgG 總量的 1-2%,因此,將導(dǎo)致抗原產(chǎn)量低。

6.  IP 裂解緩沖液已進(jìn)行過代表性細(xì)胞類型的檢測,包括但不限于下列細(xì)胞系:  HeLa, Jjurkat,K562,A431,A549,MOPC,NIH  3T3 和 U2OS。通常情況下,106的 HeLa 細(xì)胞可以產(chǎn)生約10 mg的細(xì)胞團(tuán)塊,按照~3 μg/μl的配比使用 IP裂解緩沖液(即 100 μl IP裂解緩沖液可以裂解~300 μg細(xì)胞團(tuán)塊 )。  

7. 為了獲得最佳結(jié)果,可添加蛋白酶抑制劑或/和磷酸酶抑制劑,以盡量減少細(xì)胞裂解液中蛋白質(zhì)的降解和去磷酸化。

8. IP裂解緩沖液可兼容BCA蛋白濃度測定試劑盒(貨號:RTP7102)。

9. 在免疫沉淀時,建議按照步驟2.2使用與捕獲抗體種屬相同的正常IgG配制相同稀釋比的工作液作為陰性對照。本試劑盒中未提供IgG,客戶請自備。

● 操作步驟:

一. 哺乳動物細(xì)胞裂解 :

1.1 裂解貼壁細(xì)胞 :

1.1.1 小心去除細(xì)胞中的培養(yǎng)基。

1.1.2 用 PBS清洗細(xì)胞一次。

1.1.3 將冰上預(yù)冷的 IP裂解緩沖液加入細(xì)胞中(表1);冰上孵育 5 分鐘并間歇混勻;用細(xì)胞刮刀刮下細(xì)胞或用移液器吹打下細(xì)胞。

表 1 不同標(biāo)準(zhǔn)的細(xì)胞培養(yǎng)皿/板中 IP裂解緩沖液的建議添加量

培養(yǎng)皿/板的尺寸或表面積

IP裂解緩沖液體積

100 cm培養(yǎng)皿

500-1000 μl

60 cm培養(yǎng)皿

250-500 μl

6孔板

200-400μl每孔

24孔板

100-200μl每孔

1.1.4 將細(xì)胞裂解液轉(zhuǎn)移到微量離心管中,冰浴10-30分鐘,間歇混勻;13000 ×g離心10分鐘以沉淀細(xì)胞碎片。

1.1.5 將上清轉(zhuǎn)移到一個新的微量離心管中用于進(jìn)行蛋白濃度測定和后續(xù)分析。

1.2 裂解懸浮細(xì)胞:

1.2.1將細(xì)胞懸浮液在 450 ×g下離心 5分鐘以沉淀細(xì)胞;棄掉上清。

1.2.2將細(xì)胞團(tuán)塊用 PBS重懸洗滌一次。450× g離心 5分鐘再次沉淀細(xì)胞。

1.2.3將冰上預(yù)冷的 IP裂解緩沖液加到細(xì)胞團(tuán)塊中。每 50 μl濕重細(xì)胞沉淀體積加入 500 μl IP裂解緩沖液。注:(五百萬,5×106) Jurkat細(xì)胞,其細(xì)胞沉淀體積(PCV,Packed Cell Volume)大約為50 μl。

1.2.4  將細(xì)胞裂解液在冰上孵育10-30分鐘并間歇混勻。13000 ×g離心10 分鐘去除細(xì)胞碎片。

1.2.5 將上清轉(zhuǎn)移到一個新的微量離心管中用于進(jìn)行蛋白濃度測定和后續(xù)分析。

二. 制備免疫復(fù)合物:

 注:樣品用量和孵育時間取決于每個特定的抗體-抗原體系,并且可能需要優(yōu)化實驗方案以使產(chǎn)量最大化。以下方案是針對 2-10 μg 親和純化的抗體(Protein A/G 瓊脂糖樹脂使用20 μl),且可以根據(jù)需要按比例放大。

2.1 將 2-10 μg親和純化的抗體與步驟1.2.5得到的細(xì)胞裂解液上清在微量離心管中混合,混合體積控制在300 - 600 μl。每個IP反應(yīng)總蛋白建議量是 500-1000 μg。

2.2 可選:可以使用與IP捕獲抗體種屬相同的正常IgG配制相同稀釋比的工作液,作為陰性對照。如IP捕獲抗體使用兔源抗體,陰性對照則使用兔IgG。

2.3 在 4旋轉(zhuǎn)孵育 1小時至過夜,以形成免疫復(fù)合物。

三. 捕獲免疫復(fù)合物:

3.1 輕旋 Protein A/G 瓊脂糖樹脂,以獲得均一的懸浮液。使用大口徑或截短槍頭取20 μl樹脂漿液加入離心柱中。將離心柱放于收集管中,1000×g 離心1分鐘,棄掉流穿液體。

3.2 用200 μl預(yù)冷的洗滌緩沖液洗滌樹脂兩次;每次洗滌后棄掉流穿液體。

3.3 將步驟2.3的免疫復(fù)合物樣品加入含有Protein A/G 瓊脂糖樹脂的離心柱中,蓋上管蓋溫和地上下翻轉(zhuǎn)常溫孵育 1 小時。

3.4 將離心柱置于一干凈的2 ml離心管中(自備)。1000×g 離心1分鐘并保留流穿液體。

注:在確定 IP反應(yīng)成功之前不要丟棄該液體。

3.5 將離心柱置于一個新的1.5 ml離心管中(自備),加入200 μl 洗滌緩沖液,1000×g 離心 1 分鐘,棄流穿液。

3.6 重復(fù)步驟3.5二次。

四. 洗脫免疫復(fù)合物:

注:有兩種方案可以洗脫免疫復(fù)合物。變性緩沖液洗脫適用于 Western blot 分析;酸性洗脫液適用于酶法或功能測定。

4.1 變性洗脫液洗脫:

4.1.1 將含有樹脂的離心柱置于一個新的1.5 ml離心管中(自備),加入50 μl 變性洗脫液,在95℃下孵育10 分鐘。

4.1.2 1000×g 離心1 min,收集洗脫液。

注:加熱含有變性洗脫液的樹脂后,該樹脂將不能被重復(fù)使用且必須丟棄。

4.2 酸性洗脫液洗脫:

4.2.1 將離心柱置于一個新的1.5 ml離心管中(自備),加入 50 μl酸性洗脫液。在常溫下孵育 10分鐘。1000×g 離心1min,收集洗脫液。

4.2.2 為了中和低pH 值的酸性洗脫緩沖液(例如為了進(jìn)行下游的酶法或功能測定),洗脫后立即向洗脫液中加入1/10體積中和緩沖液,如50 μl洗脫液加入5 μl中和緩沖液,混勻。


● 實驗示例:

 

1 制備免疫復(fù)合物:

GAPDH-IP:5 μl GAPDH兔單抗加400μl(640 μg)K562總蛋白(1.6 μg/μl),4度 混勻1h

IgG-IP:1 μl兔IgG加400 μl(640 μg)K562總蛋白(1.6 μg/μl),4度 混勻1h

2 捕獲免疫復(fù)合物:

取20 μl Protein A/G加入離心柱中,1000g min;100 μl IP裂解液洗滌兩次;

將免疫復(fù)合物上柱,RT 混勻1h,形成Protein A/G-Ab-An復(fù)合物;200 μl 1×TBS洗滌柱3次

3 洗脫免疫復(fù)合物-變性洗脫:

用干凈的1.5ml 離心管做收集管,柱子中加入50 μl 變性洗脫液,95度 10 min;1000g 1min,收集管內(nèi)為待測樣品;IgG-IP 上樣10 μl,GAPDH-IP 上樣5,10,15 μl。

Input為IP裂解液提取K562總蛋白,5×BME配制成1μg/μl上樣液,上樣10 μl(10 μg)

4 電泳:4-20% 梯度膠 200V 50min

5 轉(zhuǎn)膜:Turbo快速半干轉(zhuǎn),濾布,0.22 NC膜,恒流1.3A 10min。

6 快封:快速封閉液(WR5020 )RT封閉10min

7 檢測:兔GAPDH單抗1:5000 RT 1h,羊抗兔IgG-HRP 1:5000 RT 1h,ECL 1秒


 
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