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動物膜蛋白提取試劑盒(細(xì)胞樣品)

動物膜蛋白提取試劑盒(細(xì)胞樣品)

產(chǎn)品編號:RTD8111

產(chǎn)品規(guī)格:50次

數(shù)量
價格 ¥600


動物膜蛋白提取試劑盒
(細(xì)胞樣品)

(Animal Membrane Protein Extraction Kit for Cells)

產(chǎn)品貨號

名稱

規(guī)格

RTD8111

動物細(xì)胞膜蛋白提取試劑盒(細(xì)胞樣品)

50

 

 

 

產(chǎn)品簡介

動物膜蛋白提取試劑盒(細(xì)胞樣品)(Animal Membrane Protein Extraction Kit for Cells)提供了一種簡便的地從培養(yǎng)細(xì)胞或貼壁細(xì)胞中提取膜蛋白的方法。提取的膜蛋白不僅包括質(zhì)膜上的膜蛋白,也包括細(xì)胞器膜如線粒體膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜和高爾基體膜上的膜蛋白。

本產(chǎn)品與許多用于分離膜蛋白的程序不同,該試劑盒不需要超聲,不需要耗時的超速離心,不使用去垢劑,最大限度地保持了膜蛋白在細(xì)胞內(nèi)的原始狀態(tài)。提取的基本原理是通過提取溶液和離心柱的協(xié)調(diào)作用提取得到高純度的膜蛋白。膜蛋白提取溶液可以溫和作用于細(xì)胞膜,改變細(xì)胞的滲透壓,然后在高速離心下細(xì)胞通過離心柱,這個過程中細(xì)胞膜會破裂;收集液700 g低速離心分離去除細(xì)胞核,因此消除了膜組分中細(xì)胞核組份的污染;隨后上清使用常規(guī)臺式低溫離心機(jī)(無需超速離心)16000 g高速離心,沉淀即為膜蛋白。

該產(chǎn)品約60分鐘即可完成培養(yǎng)細(xì)胞膜蛋白的提取。膜蛋白是在溫和、非變性條件下提取的,結(jié)合不同的溶解液,溶解后的膜蛋白可以用于SDS-PAGE變性電泳檢測、Blue Native非變性電泳檢測以及等電聚焦電泳等。另外,膜蛋白也可以用于酶活性測定,免疫沉淀,ELISA測定等。

對于細(xì)胞樣品,如果每次使用細(xì)胞的數(shù)量為2-5×106,本試劑盒可以提取125個樣品;如果每次使用的細(xì)胞數(shù)量為1×107細(xì)胞,本試劑盒可以提取50個樣品。

產(chǎn)品組成

序號

產(chǎn)品編號

名稱

規(guī)格

貯存

1

RTD8111-01

膜蛋白提取溶液

25 ml

4℃

2

PS1020

變性蛋白溶解液

5 ml

RT

3

PN1020

膜蛋白重懸液(BN電泳用)

5 ml

4

4

DM1080

膜蛋白增溶液A

5 ml

4℃;

配制后-20℃貯存

5

PL130-01

10×膜蛋白A型上樣緩沖液(配套膜蛋白增溶液A使用)

1 ml

4

6

CD-50

離心柱套裝

(包含離心柱和2ml連蓋收集管)


50

RT






 

 

說明書

-

 

貯存、效期和運(yùn)輸:

根據(jù)標(biāo)簽溫度貯存;一年有效;試劑盒常溫運(yùn)輸。

用前必讀:

1. 離心機(jī)請調(diào)整成RCF/g模式,按照離心力設(shè)置離心機(jī)(不要根據(jù)轉(zhuǎn)速rpm模式設(shè)置),所有離心步驟都需要在4℃低溫離心機(jī)中進(jìn)行。

2. 將膜蛋白提取溶液混勻后放置于冰上。將離心柱套入2 ml連蓋收集管中,蓋好管蓋,放置于冰上預(yù)冷。

3. 蛋白提取推薦添加蛋白酶抑制劑(自備,試劑盒不提供),根據(jù)蛋白酶抑制劑母液濃度提前添加在膜蛋白提取溶液中(如抑制劑母液是 100×,添加時按照1:100添加,即1ml膜蛋白提取溶液添加10μl抑制劑)。研究蛋白磷酸化,需要添加磷酸酶抑制劑(自備,試劑盒不提供)。

4. 蛋白定量推薦使用BCA方法,可以選擇BCA蛋白濃度測定試劑盒(貨號:RTP7102)。

使用方法:

培養(yǎng)細(xì)胞膜蛋白提?。?/b>

1.1 準(zhǔn)備溶液:

混勻膜蛋白提取溶液,立即放置在冰上。取適當(dāng)量的溶液,在使用前數(shù)分鐘內(nèi)加入蛋白酶抑制劑(自備,試劑盒不提供),隨后立即放于冰上待用。按照下表大體估算膜蛋白提取溶液使用體積:

細(xì)胞類型

培養(yǎng)器皿

細(xì)胞數(shù)量

細(xì)胞沉淀體積(PCV)(μl

膜蛋白提取溶液(μl

懸浮細(xì)胞

 

2-5×106

20-50

200

 

5-10×106

50

500

貼壁細(xì)胞

96孔板

~1×105

調(diào)整細(xì)胞數(shù)目到2-5×106

200

24孔板

~5×105

調(diào)整細(xì)胞數(shù)目到2-5×106

200

6孔板

~2.5×106

~25

200

25cm2培養(yǎng)瓶

~2×106

~20

200

75cm2培養(yǎng)瓶

~8×106

~80

500

35 mm培養(yǎng)皿

~2×106

~20

200

60 mm培養(yǎng)皿

~5×106

~50

500

100 mm培養(yǎng)皿

~1.5×107

調(diào)整細(xì)胞數(shù)目到2-5×106

200

注: (二百萬,2×106)HeLa細(xì)胞,其細(xì)胞沉淀體積(PCM,Packed Cell Volume)大約為20 μl。

1.2 準(zhǔn)備細(xì)胞:

1.2.1 對于貼壁細(xì)胞:細(xì)胞用PBS漂洗一遍,棄PBS;再加入適量PBS,用細(xì)胞刮刀刮下細(xì)胞,或用0.02% EDTA(0.5 mM)溶液處理細(xì)胞使細(xì)胞不再貼壁很緊,并用移液器吹打下細(xì)胞。400 g(~2000 rpm) 4℃離心5 min收集細(xì)胞,盡最大努力吸盡上清,留下細(xì)胞沉淀備用。盡量避免用胰酶消化細(xì)胞,以免胰酶降解需提取的目的蛋白。

1.2.2 對于懸浮細(xì)胞:400 g(~2000 rpm)4℃離心5 min收集細(xì)胞,用PBS洗一遍,離心收集細(xì)胞,盡最大努力吸盡上清,留下細(xì)胞沉淀備用。

1.3 裂解細(xì)胞膜:

1.3.1細(xì)胞沉淀中加入準(zhǔn)備好的膜蛋白提取溶液(含蛋白酶抑制劑),用移液器吹打重懸細(xì)胞沉淀,渦旋劇烈震蕩30-60冰浴處理10分鐘,間歇2-3混勻。

注:提取溶液使用推薦經(jīng)驗值:起始細(xì)胞數(shù)低于5×106加入 200 μl 提取溶液,起始細(xì)胞數(shù)量5×106-1×107加入500 μl提取溶液。如果細(xì)胞數(shù)目低于1×106或高于1×107,建議調(diào)整細(xì)胞數(shù)目在2-5×106范圍內(nèi)。

1.3.2 將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到離心柱中,蓋上管蓋,16,000 g(~13000 rpm) 4℃離心1分鐘,離心后收集管底部會有沉淀形成。

     注:離心柱最大體積為600 μl;確保離心機(jī)可以在10秒內(nèi)達(dá)到16000 g。

   1.3.3 棄去離心柱,蓋好2 ml收集管管蓋,用1ml移液器輕柔吹打重懸收集管中的沉淀。

1.4 去除細(xì)胞核:

溶液700 g(~2700 rpm) 4℃離心1分鐘,用200 μl吸頭小心將上清(上清稍有渾濁)轉(zhuǎn)移到新的1.5 ml離心管中。注意:轉(zhuǎn)速不要超過700g,否則會降低膜蛋白的得率。

     關(guān)鍵步驟:吸取上清時不要觸及沉淀,甚至可以丟棄部分上清不吸取,以免上清(含膜蛋白)中污染核蛋白。如果使用200 μl提取溶液,建議吸取150 μl上清;使用500 μl提取溶液,建議吸取400 μl上清。此步驟得到的細(xì)胞核純度不高,混雜有沒有完全破碎的完整細(xì)胞,不建議用于相關(guān)實驗。

1.5 沉淀膜蛋白:

上清溶液16000 g(~13000 rpm) 4℃離心30分鐘,用200 μl吸頭吸棄上清,沉淀即為提取的膜蛋白。上清是胞漿蛋白,如需要可保存?zhèn)溆谩?

關(guān)鍵步驟:此步驟必須完全將上清吸取干凈,可以分次吸取上清,最后用10 μl吸頭將殘余上清徹底吸凈,以免膜蛋白中污染胞漿蛋白。

  膜蛋白溶解:

膜蛋白沉淀可以根據(jù)下游實驗需求用50 μl相應(yīng)溶解液溶解。

注:不建議加入超過50 μl溶解液,會導(dǎo)致蛋白濃度偏低。

2.1 膜蛋白變性樣品處理:

2.1.1 建議使用50 μl變性蛋白溶解液(貨號:PS1020)溶解膜蛋白;

2.1.2 BCA方法測定蛋白濃度;

2.1.3用變性蛋白溶解液調(diào)整蛋白濃度為1 μg/μl,按需分裝,每管50 μl,-80℃保存待用;

2.1.4取一管50 μl樣品加入SDS-PAGE上樣緩沖液(貨號:PL080,PL113,PL121)處理,建議調(diào)整上樣液濃度為0.5 μg/μl;對于多次跨膜蛋白(Multi-pass membrane protein)的變性電泳檢測,樣品建議使用37℃處理30分鐘或者70度處理10分鐘,不要95℃加熱5分鐘,因為在95℃高溫情況下,多次跨膜蛋白極易聚集形成多聚體,樣品會聚集,WB檢測會表現(xiàn)為比實際蛋白大小更大的分子量;

2.1.5 使用SDS-PAGE凝膠(貨號:RTD6132,RTD6116)電泳,每個泳道上樣10-40 μl(5-20 μg)。

2.2 膜蛋白BN非變性樣品處理:

2.2.1 建議使用50 μl膜蛋白重懸液(BN電泳用)(貨號:PN1020)重懸膜蛋白沉淀;

2.2.2 BCA方法測定蛋白濃度(貨號:RTP7102);

2.2.3 用膜蛋白重懸液(BN電泳用)調(diào)整蛋白濃度為1 μg/μl,按需分裝,每管50 μl,-80℃保存待用;

2.2.4 取一管50 μl樣品,溶化混勻后4℃ 16000 g 5分鐘,去除上清,保留沉淀;

2.2.5 沉淀中加入50 μl膜蛋白增溶液A(貨號:DM1080),輕柔重懸沉淀,盡量不產(chǎn)生氣泡,冰浴10分鐘;

膜蛋白增溶液A配制方法:在增溶劑粉末管中加入2.5 ml溶解緩沖液,加入超純水精準(zhǔn)定容至5 ml,徹底混勻,增溶液中DDM終濃度為1%。

2.2.6 4℃ 16000 g 15分鐘,取上清至一干凈1.5 ml離心管中即為增溶后膜蛋白溶液(小心不要吸取沉淀),此時得到的膜蛋白濃度為1 μg/μl,其中去垢劑DDM(n-Dodecyl β-D-maltoside,β-DM n-十二烷基-β-D-麥芽糖苷)終濃度為1%;

2.2.7 膜蛋白溶液中加入1/10體積10×膜蛋白A型上樣緩沖液(配套膜蛋白增溶液A使用)(貨號:PL130),使用BN凝膠電泳(貨號:RTD6139,RTD6140),每個泳道上樣5-20 μg。

2.3 膜蛋白等電聚焦樣品處理(2D凝膠第一維電泳):

建議膜蛋白沉淀中使用溶解液:7 M尿素,2 M硫脲, 2%CHAPS,20mM DTT(自備,試劑盒不提供)。

  關(guān)于膜蛋白產(chǎn)量和質(zhì)量的評價:

 3.1 膜蛋白產(chǎn)量:

細(xì)胞系

細(xì)胞數(shù)量

膜蛋白

K562

1×107

50-80 μg

Jurkat

1×107

80-100 μg

Hela

1×107

100-150 μg

NIH-3T3

1×107

80-120 μg

3.2 膜蛋白質(zhì)量評價:

膜蛋白質(zhì)量評價首先看提取的蛋白是否是膜蛋白,其次要看膜蛋白是否有明顯的富集,其三要看提出的膜蛋白是否有其他組分交叉污染,最后看提取的膜蛋白中是否可以檢測出目的蛋白。使用專門的膜內(nèi)參檢測(下表),可以初步確認(rèn)提出的是膜蛋白。膜蛋白是否有效富集需要用總蛋白作為對照,與總蛋白相比,膜蛋白中膜蛋白內(nèi)參是否有明顯富集。膜蛋白中的交叉污染可以用其他組分內(nèi)參檢測膜蛋白樣品,如關(guān)注膜蛋白中是否有細(xì)胞核蛋白污染,可以使用核蛋白內(nèi)參如Lamin B1檢測膜蛋白,檢測無條帶即說明膜蛋白與細(xì)胞核組分無交叉污染。用目標(biāo)蛋白抗體檢測膜蛋白,驗證是否可以檢測到目的蛋白,蛋白大小是否符合預(yù)期。

位置

內(nèi)參名稱

大小 kD

細(xì)胞膜

Na-K ATPase

100

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜

Calnexin

~90

線粒體膜

COX IV

17

許多研究人員利用 WB對分離的膜蛋白進(jìn)行純度檢測,經(jīng)常發(fā)現(xiàn)一些常用的胞漿內(nèi)參能在膜蛋白中檢測到,例如β-actin[1], GAPDH [2] 和  β-tubulin [3],這是由于這些胞漿內(nèi)參不僅存在于胞漿也存在于質(zhì)膜中,因此可以在膜蛋白中檢測到胞漿內(nèi)參。更多信息,請參閱以下論文:

1. Gruenstein E., et al. (1975). Actin associated with membranes from 3T3 mouse fibroblast and Hela cells. Journal of cell Biology. 64:223-234.  

2. Terrasse R., et al. (2012). Human and pneumococcal cell surface glyceraldehydes  -3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) proteins are both ligands of human C1q protein. J. Biol. Chem. 287:42620-42633.

3. Wolff J. (2009). Plasma membrane tubulin. Biochemica et BiophysicaActa. (BBA)-Biomembranes 1788:1415-1433.

實驗示例:



樣品:K562細(xì)胞,膜蛋白提取試劑盒提取膜蛋白(M)和胞漿蛋白(C),RIPA提取總蛋白(TP)

溫度處理:樣品與SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液(貨號:PL080)混合,37度處理30min,70度處理10min,95度處理5min

電泳:4-18% RealPAGE預(yù)制膠(貨號:RTD6119-0420),蛋白上樣量均為5 μg,恒壓200V  55min

轉(zhuǎn)膜:0.45μm PVDF膜,1×RealBlot轉(zhuǎn)膜緩沖液(貨號:RT5020)濕轉(zhuǎn),恒流400 mA 35min。

封閉:快速封閉液(貨號:WR5020)  RT  10 min

剝離:Western一抗二抗去除液(弱堿,溫和型) (貨號:WS1200),37度搖床15 min

一抗:1 Na-K ATPase  1:5000;2 Calnexin 1:500;3 β-Tubulin 1:5000 ;4 β-Actin 1:10000;5 GAPDH 1:10000; 6 H3 1:10000;7 COXIV 1:5000;常溫?fù)u床孵育60min

二抗:羊抗兔IgG-HRP 1:5000(貨號:HGR1020),羊抗鼠IgG-HRP 1:5000(貨號:HGM1060),常溫?fù)u床孵育60min

檢測:ECL發(fā)光檢測(貨號:EC2520)


 
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