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柱式動物胞漿蛋白提取試劑盒(細胞樣品,非變性提取,不含去垢劑)

柱式動物胞漿蛋白提取試劑盒(細胞樣品,非變性提取,不含去垢劑)

產(chǎn)品編號:RTD8106

產(chǎn)品規(guī)格:50次

數(shù)量
價格 ¥300

柱式動物胞漿蛋白提取試劑盒(細胞樣品,非變性提取,不含去垢劑)

(Column Animal Cells Native Protein Extraction Kit,Detergent-free)

貨號

名稱

規(guī)格

RTD8106

柱式動物胞漿蛋白提取試劑盒(細胞樣品,非變性提取,不含去垢劑)

50





產(chǎn)品簡介

蛋白提取過程中經(jīng)常使用去垢劑裂解細胞,如NP-40,Triton X-100,SDS等。然而這些去垢劑會對提取的蛋白后續(xù)功能研究產(chǎn)生影響。如去垢劑會影響蛋白的熒光標(biāo)記;高濃度的去垢劑會影響蛋白互作研究;陰離子去垢劑如SDS提取得到變性蛋白,不利于蛋白活性研究;含去垢劑的蛋白樣品能與考馬斯亮藍G-250結(jié)合,影響B(tài)lue Native電泳的分離效果。

本試劑盒采用不含去垢劑的裂解緩沖液,在低滲透壓條件下,使細胞充分膨脹,然后結(jié)合離心柱離心,有效破壞細胞膜,釋放出細胞內(nèi)蛋白,然后通過離心得到活性蛋白。另外,裂解緩沖液中也不含有還原劑如DTT和BME等,能有效保持蛋白的天然結(jié)構(gòu)。

對于細胞樣品,如果每個樣品的數(shù)量為5×106個細胞,本試劑盒可以抽提50個樣品。

使用該產(chǎn)品提取的蛋白可以用于普通非變性電泳(Laemmli系統(tǒng))(貨號:RTD6130,RTD6135)或Blue Native系統(tǒng)(貨號:RTD6140)。

注:由于提取緩沖液的適用性,本試劑盒主要提取得到的是胞漿內(nèi)的可溶性蛋白,對細胞膜蛋白,細胞器蛋白,細胞核蛋白提取效率不高,不建議使用。

● 產(chǎn)品組成

產(chǎn)品編號

名稱

規(guī)格

貯存

RTD8106-01

非變性裂解緩沖液

25 ml

4℃

CD-50

離心柱套裝

(包含離心柱和2ml連蓋收集管)

50

RT

●  貯存、效期及運輸:

按照標(biāo)簽溫度貯存;有效期一年;常溫運輸。

用前必讀:

1. 離心機請調(diào)整成RCF/g模式,按照離心力設(shè)置離心機(不要根據(jù)轉(zhuǎn)速rpm模式設(shè)置),所有離心步驟都需要在4℃低溫離心機中進行。

2. 溶液混勻后放置于冰上。將離心柱套入2 ml連蓋收集管中,蓋好管蓋,放置于冰上預(yù)冷。

3. 蛋白提取推薦添加蛋白酶抑制劑(自備,試劑盒不提供),根據(jù)蛋白酶抑制劑母液濃度提前添加在裂解緩沖液中(添加時按照1:100添加,即1ml裂解緩沖液 添加10 μl抑制劑)。研究蛋白磷酸化,需要添加磷酸酶抑制劑(自備,試劑盒不提供)。

4. 蛋白定量推薦使用BCA方法,可以選擇BCA蛋白濃度測定試劑盒(貨號:RTP7102)。

 

使用方法:

培養(yǎng)細胞活性蛋白提取:

1.1 即用型裂解緩沖液配制:

取適當(dāng)體積的預(yù)冷裂解緩沖液,在使用前數(shù)分鐘內(nèi)加入1/100體積的蛋白酶抑制劑(100×)(自備,試劑盒不提供),如果進行蛋白磷酸化研究,需要加入1/100體積的磷酸酶抑制劑(100×)(自備,試劑盒不提供),隨后立即放于冰上待用(30分鐘內(nèi)使用)。

按照下表大體估算裂解緩沖液使用體積:

細胞類型

培養(yǎng)器皿

細胞數(shù)量

細胞沉淀體積(PCV)(μl

裂解緩沖液(μl

懸浮細胞

 

2-5×106

20-50

200

 

5-10×106

50

500

貼壁細胞

96孔板

~1×105

調(diào)整細胞數(shù)目到2-5×106

200

24孔板

~5×105

調(diào)整細胞數(shù)目到2-5×106

200

6孔板

~2.5×106

~25

200

25cm2培養(yǎng)瓶

~2×106

~20

200

75cm2培養(yǎng)瓶

~8×106

~80

500

35 mm培養(yǎng)皿

~2×106

~20

200

60 mm培養(yǎng)皿

~5×106

~50

500

100 mm培養(yǎng)皿

~1.5×107

調(diào)整細胞數(shù)目到2-5×106

200

注: (二百萬,2×106)HeLa細胞,其細胞沉淀體積(PCV,Packed Cell Volume)大約為20 μl。

1.2 準(zhǔn)備細胞:

1.2.1 對于貼壁細胞:細胞用PBS漂洗一遍,棄PBS;再加入適量PBS,用細胞刮刀刮下細胞,或用0.02% EDTA(0.5 mM)溶液處理細胞使細胞不再貼壁很緊,并用移液器吹打下細胞。400 g(~2000 rpm) 4℃離心5 min收集細胞,盡最大努力吸盡上清,留下細胞沉淀備用。盡量避免用胰酶消化細胞,以免胰酶降解需抽提的目的蛋白。

1.2.2 對于懸浮細胞:400 g(~2000 rpm)4℃離心5 min收集細胞,用PBS洗一遍,離心收集細胞,盡最大努力吸盡上清,留下細胞沉淀備用。

1.3 裂解細胞膜:

1.3.1細胞沉淀中加入準(zhǔn)備好的裂解緩沖液(含蛋白酶抑制劑),用移液器吹打重懸細胞沉淀,渦旋劇烈震蕩30-60,冰浴處理10分鐘,間歇2-3次混勻。

注:裂解緩沖液使用推薦經(jīng)驗值:起始細胞數(shù)低于5×106加入 200 μl 裂解緩沖液,起始細胞數(shù)在5×106-1×107之間加入500 μl。如果細胞數(shù)目低于1×106或高于1×107,建議調(diào)整細胞數(shù)目在2-5×106范圍內(nèi)。

1.3.2 將細胞懸液轉(zhuǎn)移到離心柱中,蓋上管蓋,16,000 g(~13000 rpm) 4℃離心1分鐘,離心后可見收集管底部有沉淀形成。

     注:離心柱最大體積為600 μl;確保離心機轉(zhuǎn)速可以在1分鐘內(nèi)升速到16000 g。

   1.3.3 棄去離心柱,蓋好2 ml收集管管蓋,用1ml移液器輕柔吹打重懸收集管中的沉淀。

1.4 去除細胞核和未破碎的細胞:

將懸浮溶液16000 g(~13000 rpm) 4℃離心15分鐘。

1.5 收集上清:

收集上清即為胞漿蛋白,其蛋白濃度約為0.5-2 μg/μl,不同細胞略有不同。

關(guān)鍵步驟:吸取上清時不要觸及沉淀,甚至可以丟棄部分上清不吸取,以免上清中污染其他蛋白。

實驗示例:

2.1 電泳檢測:

5×106 K562細胞,400g 3min收集,PBS漂洗一次;加500 μl 即用型提取緩沖液(含蛋白酶抑制劑),震蕩 60秒,冰浴10min;16000g 1min 過離心柱;重懸沉淀;4度 16000g 15 min,取上清即為胞漿活性蛋白。BCA測定蛋白濃度,蛋白得率2×108細胞提取蛋白量約1.5 mg。BN電泳(右圖):RTD6140 配制10% BN膠。使用 4×BN蛋白上樣緩沖液(貨號:PL114)調(diào)整上樣濃度為0.5μg/μl。1×藍色陰極電泳緩沖液 200V 50min,更換為1×無色陰極緩沖液,電泳時間共93min,F(xiàn)astBlue蛋白染色液染色。變性電泳(左圖):RealPAGE 4-18%預(yù)制膠,用RIPA提取總蛋白(RIPA-TP)做對照樣品,使用 含BME上樣緩沖液調(diào)整上樣濃度為0.5μg/μl,200V 60min,F(xiàn)astBlue蛋白染色液染色。

2.2 WB檢測:

1 樣品:柱式動物胞漿蛋白提取試劑盒(RTD8106)提取K562總蛋白(活性提?。?;
            柱式動物總蛋白提取試劑盒(RTD8302)提取K562總蛋白(變性提?。?br /> 2 電泳:RealPAGE Tris-Gly預(yù)制膠4-15%,。非變性電泳:1×TG;變性電泳:1×TGS
3 轉(zhuǎn)膜:0.22μm NC膜;伯樂Turbo半干轉(zhuǎn),濾布,一槽兩膠,RealBlot快速半干轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)膜緩沖液(RT5030),
             恒流2.5A 15min
4 封閉:Western快速封閉液(WR5020)快封10分鐘
5 一抗:β-Tubulin 1:5000(RGT2130)RT 60min;二抗-羊抗鼠IgG-HRP 1:5000(HGM1060) RT 60min
6 RealECL發(fā)光液(EC2520) 曝光1S
右圖:為同樣樣品變性電泳,同時轉(zhuǎn)膜,背靠背孵育.
結(jié)論:
1 β-Tubulin可以作為Tris-甘氨酸非變性系統(tǒng)的對照,結(jié)果為多種聚體。
2 柱式動物胞漿蛋白提取試劑盒(RTD8106)可以很好地非變性提取可溶性蛋白
3 RTD6137 440kD可以轉(zhuǎn)到膜上,作為分子量參照 


 
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