柱式動物胞漿蛋白提取試劑盒(細胞樣品,非變性提取,不含去垢劑)
(Column Animal
Cells Native Protein Extraction Kit，Detergent-free)
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貨號
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名稱
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規(guī)格
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RTD8106
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柱式動物胞漿蛋白提取試劑盒(細胞樣品,非變性提取,不含去垢劑)
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50次
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● 產(chǎn)品簡介
蛋白提取過程中經(jīng)常使用去垢劑裂解細胞，如NP-40，Triton
X-100，SDS等。然而這些去垢劑會對提取的蛋白后續(xù)功能研究產(chǎn)生影響。如去垢劑會影響蛋白的熒光標(biāo)記；高濃度的去垢劑會影響蛋白互作研究；陰離子去垢劑如SDS提取得到變性蛋白，不利于蛋白活性研究；含去垢劑的蛋白樣品能與考馬斯亮藍G-250結(jié)合，影響B(tài)lue
Native電泳的分離效果。
本試劑盒采用不含去垢劑的裂解緩沖液，在低滲透壓條件下，使細胞充分膨脹，然后結(jié)合離心柱離心，有效破壞細胞膜，釋放出細胞內(nèi)蛋白，然后通過離心得到活性蛋白。另外，裂解緩沖液中也不含有還原劑如DTT和BME等，能有效保持蛋白的天然結(jié)構(gòu)。
對于細胞樣品，如果每個樣品的數(shù)量為5×106個細胞，本試劑盒可以抽提50個樣品。
使用該產(chǎn)品提取的蛋白可以用于普通非變性電泳（Laemmli系統(tǒng)）（貨號：RTD6130，RTD6135）或Blue
Native系統(tǒng)（貨號：RTD6140）。
注：由于提取緩沖液的適用性，本試劑盒主要提取得到的是胞漿內(nèi)的可溶性蛋白，對細胞膜蛋白，細胞器蛋白，細胞核蛋白提取效率不高，不建議使用。
● 產(chǎn)品組成
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產(chǎn)品編號
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名稱
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規(guī)格
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貯存
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RTD8106-01
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非變性裂解緩沖液
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25 ml
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4℃
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CD-50
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離心柱套裝
（包含離心柱和2ml連蓋收集管）
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50個
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RT
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● 貯存、效期及運輸：
按照標(biāo)簽溫度貯存；有效期一年；常溫運輸。
● 用前必讀：
1.
離心機請調(diào)整成RCF/g模式，按照離心力設(shè)置離心機（不要根據(jù)轉(zhuǎn)速rpm模式設(shè)置），所有離心步驟都需要在4℃低溫離心機中進行。
2.
溶液混勻后放置于冰上。將離心柱套入2
ml連蓋收集管中，蓋好管蓋，放置于冰上預(yù)冷。
3.
蛋白提取推薦添加蛋白酶抑制劑（自備，試劑盒不提供），根據(jù)蛋白酶抑制劑母液濃度提前添加在裂解緩沖液中（添加時按照1:100添加，即1ml裂解緩沖液 添加10
μl抑制劑）。研究蛋白磷酸化，需要添加磷酸酶抑制劑（自備，試劑盒不提供）。
4.
蛋白定量推薦使用BCA方法，可以選擇BCA蛋白濃度測定試劑盒（貨號：RTP7102）。
● 使用方法：
一 培養(yǎng)細胞活性蛋白提取：
1.1 即用型裂解緩沖液配制：
取適當(dāng)體積的預(yù)冷裂解緩沖液，在使用前數(shù)分鐘內(nèi)加入1/100體積的蛋白酶抑制劑（100×）（自備，試劑盒不提供），如果進行蛋白磷酸化研究，需要加入1/100體積的磷酸酶抑制劑（100×）（自備，試劑盒不提供），隨后立即放于冰上待用（30分鐘內(nèi)使用）。
按照下表大體估算裂解緩沖液使用體積：
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細胞類型
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培養(yǎng)器皿
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細胞數(shù)量
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細胞沉淀體積（PCV）（μl）
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裂解緩沖液（μl）
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懸浮細胞
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2-5×106
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20-50
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200
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5-10×106
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＞50
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500
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貼壁細胞
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96孔板
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~1×105
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調(diào)整細胞數(shù)目到2-5×106
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200
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24孔板
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~5×105
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調(diào)整細胞數(shù)目到2-5×106
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200
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6孔板
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~2.5×106
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~25
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200
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25cm2培養(yǎng)瓶
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~2×106
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~20
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200
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75cm2培養(yǎng)瓶
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~8×106
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~80
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500
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35
mm培養(yǎng)皿
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~2×106
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~20
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200
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60
mm培養(yǎng)皿
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~5×106
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~50
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500
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100
mm培養(yǎng)皿
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~1.5×107
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調(diào)整細胞數(shù)目到2-5×106
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200
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注：
(二百萬，2×106)HeLa細胞，其細胞沉淀體積（PCV，Packed Cell Volume）大約為20 μl。
1.2 準(zhǔn)備細胞：
1.2.1
對于貼壁細胞：細胞用PBS漂洗一遍，棄PBS；再加入適量PBS，用細胞刮刀刮下細胞，或用0.02%
EDTA（0.5
mM）溶液處理細胞使細胞不再貼壁很緊，并用移液器吹打下細胞。400
g（~2000
rpm）
4℃離心5
min收集細胞，盡最大努力吸盡上清，留下細胞沉淀備用。盡量避免用胰酶消化細胞，以免胰酶降解需抽提的目的蛋白。
1.2.2
對于懸浮細胞：400
g（~2000
rpm）4℃離心5
min收集細胞，用PBS洗一遍，離心收集細胞，盡最大努力吸盡上清，留下細胞沉淀備用。
1.3 裂解細胞膜：
1.3.1細胞沉淀中加入準(zhǔn)備好的裂解緩沖液（含蛋白酶抑制劑），用移液器吹打重懸細胞沉淀，渦旋劇烈震蕩30-60秒，冰浴處理10分鐘，間歇2-3次混勻。
注：裂解緩沖液使用推薦經(jīng)驗值：起始細胞數(shù)低于5×106加入
200 μl 裂解緩沖液，起始細胞數(shù)在5×106-1×107之間加入500
μl。如果細胞數(shù)目低于1×106或高于1×107，建議調(diào)整細胞數(shù)目在2-5×106范圍內(nèi)。
1.3.2
將細胞懸液轉(zhuǎn)移到離心柱中，蓋上管蓋，16,000
g（~13000
rpm）
4℃離心1分鐘，離心后可見收集管底部有沉淀形成。
注：離心柱最大體積為600 μl；確保離心機轉(zhuǎn)速可以在1分鐘內(nèi)升速到16000 g。
1.3.3 棄去離心柱，蓋好2 ml收集管管蓋，用1ml移液器輕柔吹打重懸收集管中的沉淀。
1.4 去除細胞核和未破碎的細胞：
將懸浮溶液16000 g（~13000 rpm）
4℃離心15分鐘。
1.5 收集上清：
收集上清即為胞漿蛋白，其蛋白濃度約為0.5-2 μg/μl，不同細胞略有不同。
關(guān)鍵步驟：吸取上清時不要觸及沉淀，甚至可以丟棄部分上清不吸取，以免上清中污染其他蛋白。
二 實驗示例：
2.1 電泳檢測：
5×106 K562細胞，400g 3min收集，PBS漂洗一次；加500 μl 即用型提取緩沖液（含蛋白酶抑制劑），震蕩 60秒，冰浴10min；16000g 1min 過離心柱；重懸沉淀；4度 16000g 15 min，取上清即為胞漿活性蛋白。BCA測定蛋白濃度，蛋白得率2×108細胞提取蛋白量約1.5 mg。BN電泳（右圖）：RTD6140 配制10% BN膠。使用 4×BN蛋白上樣緩沖液（貨號：PL114）調(diào)整上樣濃度為0.5μg/μl。1×藍色陰極電泳緩沖液 200V 50min，更換為1×無色陰極緩沖液，電泳時間共93min，F(xiàn)astBlue蛋白染色液染色。變性電泳（左圖）：RealPAGE 4-18%預(yù)制膠，用RIPA提取總蛋白（RIPA-TP）做對照樣品，使用 含BME上樣緩沖液調(diào)整上樣濃度為0.5μg/μl，200V 60min，F(xiàn)astBlue蛋白染色液染色。
2.2 WB檢測：
1 樣品：柱式動物胞漿蛋白提取試劑盒（RTD8106）提取K562總蛋白（活性提?。?；
柱式動物總蛋白提取試劑盒（RTD8302）提取K562總蛋白（變性提?。?br />
2 電泳：RealPAGE Tris-Gly預(yù)制膠4-15%,。非變性電泳：1×TG；變性電泳：1×TGS
3 轉(zhuǎn)膜：0.22μm NC膜；伯樂Turbo半干轉(zhuǎn)，濾布，一槽兩膠，RealBlot快速半干轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)膜緩沖液（RT5030），
恒流2.5A 15min
4 封閉：Western快速封閉液（WR5020）快封10分鐘
5 一抗：β-Tubulin 1:5000(RGT2130)RT 60min；二抗-羊抗鼠IgG-HRP 1:5000(HGM1060) RT 60min
6 RealECL發(fā)光液(EC2520) 曝光1S
右圖：為同樣樣品變性電泳，同時轉(zhuǎn)膜，背靠背孵育.
結(jié)論：
1 β-Tubulin可以作為Tris-甘氨酸非變性系統(tǒng)的對照，結(jié)果為多種聚體。
2 柱式動物胞漿蛋白提取試劑盒（RTD8106）可以很好地非變性提取可溶性蛋白
3 RTD6137 440kD可以轉(zhuǎn)到膜上，作為分子量參照