快速蛋白高靈敏度染色試劑盒

● 貯存、運(yùn)輸及效期：

常溫保存；常溫運(yùn)輸；開(kāi)封后一年有效。

● 產(chǎn)品簡(jiǎn)介

快速蛋白高靈敏度試劑盒是一種快速簡(jiǎn)單、可用于SDS-PAGE或非變性PAGE等蛋白分離后染色的試劑盒。本試劑盒也可以用于2D凝膠的染色，并且染色后兼容后續(xù)的質(zhì)譜檢測(cè)。本試劑盒只需約90分鐘內(nèi)可以完成凝膠的染色。對(duì)于BSA蛋白，檢測(cè)靈敏度可以達(dá)到0.3 ng蛋白。

本試劑盒可足夠用于25塊常規(guī)的8×10 cm凝膠的染色。

說(shuō)明書(shū)后附有實(shí)驗(yàn)記錄表格，方便記錄實(shí)驗(yàn)步驟。

● 產(chǎn)品組成：

● 注意事項(xiàng)：

1. 由于該方法染色非常靈敏，操作時(shí)請(qǐng)注意盡量使用高純度的水，并確保所使用的器皿非常清潔，最好使用潔凈的玻璃器皿。操作時(shí)必須戴手套，避免皮膚和凝膠直接接觸。

2. 需自備乙醇、冰醋酸及MilliQ級(jí)純水或雙蒸水。

3. 下述使用說(shuō)明中各種溶液的使用量適用于大小為8×10 cm厚度為0.75-1 mm的凝膠。對(duì)于更大的凝膠，各種溶液的使用量需按凝膠面積的比例放大；對(duì)于更厚的凝膠，作用時(shí)間需按照厚度的比例適當(dāng)延長(zhǎng)10-20分鐘。

4. 本說(shuō)明書(shū)所指的常溫溫為20-25℃，操作溫度較低時(shí)由于溶液的擴(kuò)散能力下降，各步驟需適當(dāng)延長(zhǎng)時(shí)間。

5. 基本顯色液(10×)在4℃低溫貯存時(shí)可能會(huì)出現(xiàn)沉淀，可在37℃水浴中溶解，并充分混勻后使用。

● 使用方法：

一. 固定步驟：

1.1 漂洗：電泳結(jié)束后，凝膠中加入100 ml雙蒸水中漂洗5分鐘，重復(fù)漂洗1次，去除凝膠表面的電泳緩沖液。

1.2 固定：取漂洗后的凝膠放入約100 ml固定液中，在搖床上常溫?fù)u動(dòng)20分鐘，搖動(dòng)速度為60-70 rpm。固定40分鐘以上甚至過(guò)夜可以進(jìn)一步降低背景。

固定液的配制 配制量100 ml

1.3 30%乙醇洗滌：

棄固定液，加入100 ml 30%乙醇，在搖床上常溫?fù)u動(dòng)10分鐘，搖動(dòng)速度為60-70 rpm。

30%乙醇的配制：

70 ml MilliQ級(jí)純水或雙蒸水中加入30 ml乙醇，混勻后即成100 ml 30%乙醇。

1.4 水漂洗：

棄30%乙醇，加入100 ml MilliQ級(jí)純水或雙蒸水，在搖床上常溫?fù)u動(dòng)5分鐘，搖動(dòng)速度為60-70 rpm；重復(fù)漂洗一次。

二. 增敏步驟：

2.1 棄水，加入100 ml增敏液(1×)，在搖床上常溫?fù)u動(dòng)2分鐘，搖動(dòng)速度為60-70 rpm。

增敏液(1×)的配制：

注：增敏液(1×)配制后需在2小時(shí)內(nèi)使用。

2.2 水漂洗(共2次)：

棄原有溶液，加入200 ml MilliQ級(jí)純水或雙蒸水，在搖床上常溫?fù)u動(dòng)1分鐘，搖動(dòng)速度為60-70 rpm。 重復(fù)此步驟一次。

三. 染色步驟：

3.1 染色：

棄水，加入100 ml染色溶液(1×)，在搖床上常溫?fù)u動(dòng)10分鐘，搖動(dòng)速度為60-70 rpm。 染色過(guò)程中，凝膠會(huì)呈微微黃色。

染色溶液(1X)的配制：

注：染色溶液(1X)配制后需在2小時(shí)內(nèi)使用。

3.2 水洗滌：

棄染色溶液，加入100 ml MilliQ級(jí)純水或雙蒸水，在搖床上常溫?fù)u動(dòng)1-1.5分鐘，搖動(dòng)速度為60-70rpm。

注意：水洗滌的時(shí)間不能超過(guò)1.5分鐘。

四. 顯色步驟：

棄水，加入100 ml顯色液，在搖床上常溫?fù)u動(dòng)3-7分鐘，直至出現(xiàn)比較理想的預(yù)期蛋白條帶，搖動(dòng)速度為60-70 rpm。

顯色液的配制 配制量100 ml

注：顯色加速液(2000×)有刺激性氣味，建議在通風(fēng)櫥內(nèi)操作；

顯色液配制后需在20分鐘內(nèi)使用。

五. 終止步驟：

5.1 漂洗：棄顯色液，加入100 ml雙蒸水在搖床上常溫?fù)u動(dòng)2分鐘，漂洗掉凝膠上殘留的顯色液。

5.2 終止染色：

棄顯色液，加入100 ml終止液(1×)，在搖床上常溫?fù)u動(dòng)10分鐘，搖動(dòng)速度為60-70 rpm。終止時(shí)有氣體產(chǎn)生屬正?，F(xiàn)象，產(chǎn)生的氣體為二氧化碳。

終止液(1×)的配制：

注：終止液(1×)配制后應(yīng)當(dāng)天使用。

5.3 水洗滌：

棄終止液，加入100 ml MilliQ級(jí)純水或雙蒸水，在搖床上常溫?fù)u動(dòng)5分鐘，搖動(dòng)速度為60-70 rpm。

六. 保存：

可在MilliQ級(jí)純水或雙蒸水中保存或采用適當(dāng)?shù)姆绞街苽涑筛赡z。

● 常見(jiàn)問(wèn)題：

一.  背景太深：

1.1. 步驟四顯色時(shí)間過(guò)長(zhǎng)。通常顯色反應(yīng)會(huì)在10分鐘內(nèi)結(jié)束，顯色反應(yīng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致背景很深。

1.2. 洗滌不充分。洗滌時(shí)間過(guò)短，或洗滌液加入的量不足，或者容器過(guò)于狹小導(dǎo)致?lián)u動(dòng)時(shí)溶液不易充分混合，或搖動(dòng)速度過(guò)慢，導(dǎo)致混勻不充分。請(qǐng)按照說(shuō)明書(shū)的建議確保各種溶液的用量和作用時(shí)間，搖床的推薦速度為60-70 rpm。

1.3 步驟1.2中凝膠中原有的緩沖液等未在固定步驟中去除干凈。一方面需確保固定的時(shí)間和固定液的用量，另一方面對(duì)于不是最常用的Bis-Tris系統(tǒng)的凝膠需要更長(zhǎng)的固定時(shí)間以充分去除凝膠中的原有緩沖成分，以降低背景。

1.4 水的純度太低。需使用大于16 MΩ·cm的高純度水。

二.  蛋白條帶非常淺：

2.1 蛋白的半胱氨酸(Cysteine)殘基的含量特別低或幾乎沒(méi)有。半胱氨酸殘基的存在對(duì)于染色非常重要，半胱氨酸殘基的含量過(guò)低會(huì)導(dǎo)致檢測(cè)靈敏度下降。

2.2 步驟3.2染色后水洗滌時(shí)間過(guò)長(zhǎng)。在染色溶液染色時(shí)需嚴(yán)格控制水洗滌的時(shí)間，水洗滌的時(shí)間不能超過(guò)1.5分鐘，否則會(huì)導(dǎo)致過(guò)多的顯色離子被洗去，導(dǎo)致檢測(cè)靈敏度下降。

2.3 上樣量不足。本試劑盒檢測(cè)BSA的靈敏度可以達(dá)到0.3 ng，對(duì)于不同的蛋白檢測(cè)靈敏度可能不同。對(duì)于一些蛋白可能需要大于1 ng的蛋白量才能被檢測(cè)到。

2.4步驟1.3和1.4的洗滌不夠充分。導(dǎo)致少量乙酸殘留，影響后續(xù)檢測(cè)。確保30%乙醇洗滌和水洗滌的用量和時(shí)間，可以適當(dāng)延長(zhǎng)洗滌時(shí)間。

三.  凝膠上出現(xiàn)小點(diǎn)或其它非蛋白的痕跡：

3.1 凝膠沒(méi)有充分被溶液浸沒(méi)。請(qǐng)注意選擇大小合適的容器，并加入足量的各種溶液，同時(shí)需保持適當(dāng)?shù)幕靹蛩俣却_保凝膠可以被溶液浸沒(méi)。

3.2 用于染色的容器沒(méi)有充分洗滌干凈。容器需先用洗滌劑充分洗滌，隨后用自來(lái)水充分沖洗，最后用高純度水再洗滌數(shù)次。該容器最好能專用于染色，并注意避免各種可能的蛋白污染。

3.3 指紋或其它壓痕。請(qǐng)注意戴手套操作，切勿直接接觸皮膚。操作時(shí)請(qǐng)注意盡量勿擠壓、

折疊或摩擦凝膠。

3.4 有金屬物質(zhì)接觸凝膠。金屬物質(zhì)例如金屬鑷子等接觸凝膠會(huì)出現(xiàn)非特異性痕跡。

四.  在60-70 kD處出現(xiàn)一片模糊的蛋白染色背景：

皮膚上脫落的角蛋白(keratin)污染了蛋白樣品。一方面需注意戴手套操作，另一方面需注意盛放蛋白樣品的容器蓋子盡量不要敞開(kāi)，甚至在取放蛋白樣品時(shí)在超凈臺(tái)內(nèi)進(jìn)行以避免可能的角蛋白污染。

五. 在凝膠的上半部分出現(xiàn)黃色背景：

5.1 樣品使用了含有DTT的上樣緩沖液。換用含有其它還原試劑如β-巰基乙醇的上樣緩沖液。

5.2 采用Tris-Glycine-SDS電泳體系。Tris-Glycine-SDS電泳體系中的Glycine會(huì)導(dǎo)致

背景凝膠的頂端出現(xiàn)輕微的黃色背景。

● 實(shí)驗(yàn)記錄表格

實(shí)驗(yàn)日期：

實(shí)驗(yàn)示例：

使用快速蛋白高靈敏度染色試劑盒 RTD6401發(fā)表部分文章列表：

1. [2022 IF=4.8] Reassortment and genomic analysis of a G9P[8]-E2 rotavirus isolated in China.

Author: Rui Peng, Dandi Li, Jindong Wang, Guangping Xiong , Mengxuan Wang, Dan Liu, Yuhang Wei, Lili Pang, Xiaoman Sun, Huiying Li, Xiangyu Kong, Saleha Shahar, Zhaojun Duan.

Product: RTD6401 快速蛋白高靈敏度染色試劑盒

Journal: Virology Journal 2023 Jun 22;20(1):135.

Institution：Universiti Teknologi Malaysia

Paper link： https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/37349792