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AnnexinV-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒

AnnexinV-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒

產(chǎn)品編號:FP2050M

產(chǎn)品規(guī)格:50次

數(shù)量
價格 ¥1000

AnnexinV-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒

AnnexinV-FITC/PI Apoptosis Detection Kit

產(chǎn)品組成:

貨號

名稱

規(guī)格

FP2050M

AnnexinV-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒

50

●  產(chǎn)品簡介:

在正常細(xì)胞中,磷脂酰絲氨酸(PS)只分布在細(xì)胞膜脂質(zhì)雙層的內(nèi)側(cè),而在細(xì)胞凋亡早期,細(xì)胞膜中的磷脂酰絲氨酸(PS)由脂膜內(nèi)側(cè)翻向外側(cè)。Annexin V 是一種分子量為35~36kD 的Ca2+依賴性磷脂結(jié)合蛋白,與磷脂酰絲氨酸有高度親和力,故可通過細(xì)胞外側(cè)暴露的磷脂酰絲氨酸與凋亡早期細(xì)胞的胞膜結(jié)合。因此Annexin V被作為檢測細(xì)胞早期凋亡的靈敏指標(biāo)之一。將Annexin V 進行熒光素FITC 標(biāo)記,以標(biāo)記了的Annexin V 作為熒光探針,利用熒光顯微鏡或流式細(xì)胞儀可檢測細(xì)胞凋亡的發(fā)生。碘化丙啶(Propidium Iodide, PI)是一種核酸染料,它不能透過完整的細(xì)胞膜,但對凋亡中晚期的細(xì)胞和死細(xì)胞,PI 能夠透過細(xì)胞膜而使細(xì)胞核染紅。因此將Annexin V 與PI 匹配使用,就可以將處于不同凋亡時期的細(xì)胞區(qū)分開來。

以每次使用5 μl Annexin V-FITC計算,本試劑盒FP2050M可以檢測50個樣品。

●  包裝組份:

產(chǎn)品編號

產(chǎn)品名稱

規(guī)格

FP2050M-1

Annexin V-FITC

250 μl

FP2050M-2

Annexin V-FITC結(jié)合液

30 ml

FP2050M-3

碘化丙啶染色液

250 μl

●  保存條件:

4oC保存,一年有效。Annexin V-FITC和碘化丙啶染色液需要避光保存。

操作步驟:

. 懸浮細(xì)胞操作流程:

1.1 誘導(dǎo)凋亡的操作步驟 (Jurkat細(xì)胞為例)

1.1.1 制備1×106個/ml 的Jurkat細(xì)胞懸液。

1.1.2 加入終濃度為1 μM 的凋亡誘導(dǎo)劑 (STS,Staurosuporine,星孢菌素)。

1.1.3 在37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)3 h。

注:1 μM Staurosuporine用于誘導(dǎo)Jurkat cell凋亡。最佳誘導(dǎo)條件請根據(jù)實驗的細(xì)胞類型與誘導(dǎo)劑調(diào)整。

1.2 Annexin V染色操作步驟:

1.2.1 將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到離心管中,500 g(2500 rpm)離心3 min,去除上清液。

1.2.3沉淀中加入PBS,500 g(2500 rpm)離心 3 min,去除上清液。重復(fù)漂洗一次。

1.2.4加入Annexin V-FITC結(jié)合液,制成終濃度為1×106 個/ml的細(xì)胞懸液。

注:加入結(jié)合液的體積根據(jù)實驗?zāi)康淖孕姓{(diào)整,一般推薦不少于500 μl。

1.2.5 取100 μl步驟1.2.4中制備的細(xì)胞懸液,加入到一個新的離心管中。

1.2.6 向細(xì)胞懸液中加入5 μl Annexin V-FITC,再加入5 μl 碘化丙啶染色液。

1.2.7 常溫下避光放置15 min,即為待檢液。

1.3 結(jié)果檢測:

1.3.1 流式細(xì)胞儀檢測:

步驟1.2.7中的待檢液中加入400 μl Annexin V-FITC結(jié)合液。激發(fā)波長Ex = 488 nm;發(fā)射波長Em = 530 nm。Annexin V-FITC的綠色熒光通過FITC通道 (FL1) 檢測;PI的紅色熒光通過PI 通道 (FL2或FL3) 檢測。注:熒光染料都存在淬滅的問題,建議1小時內(nèi)完成檢測。

1.3.2 熒光顯微鏡檢測:

取步驟1.2.7的待檢液5 μl滴于載玻片上,加5μl 抗熒光淬滅封片液,封片觀察。

注:熒光染料都存在淬滅的問題,建議染色后盡快檢測。

. 懸浮細(xì)胞操作流程:

2.1 誘導(dǎo)凋亡的操作步驟 (Caco-2細(xì)胞為例)

2.1.1 制備1×106個/ml 的Caco-2細(xì)胞懸液,將細(xì)胞懸液接種到培養(yǎng)皿或者培養(yǎng)板中。

2.1.2 在37℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)。

2.1.3加入終濃度為25 μM的凋亡誘導(dǎo)劑 (Cisplatin,順鉑)。

2.1.4 在37℃5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 days。

2.2  Annexin V染色操作步驟:

2.2.1吸出細(xì)胞培養(yǎng)液至離心管中待用,細(xì)胞用PBS洗滌,加入適量不含EDTA的胰酶細(xì)胞消化液消化細(xì)胞。

2.2.2 常溫孵育至輕輕吹打可以使貼壁細(xì)胞吹打下來時,吸除胰酶細(xì)胞消化液。需避免胰酶的過度消化。

2.2.3加入步驟2.2.1中收集的細(xì)胞培養(yǎng)液,稍混勻,轉(zhuǎn)移到離心管內(nèi),2000 rpm 5 min,小心吸除上清。

注意:加入的細(xì)胞培養(yǎng)液一方面可以收集已經(jīng)懸浮的發(fā)生凋亡或壞死的細(xì)胞,另一方面細(xì)胞培養(yǎng)液中的血清可以有效抑制或中和殘留的胰酶;殘留的胰酶會消化并降解后續(xù)加入的Annexin V-FITC導(dǎo)致染色失敗。

2.2.4 細(xì)胞沉淀中加入預(yù)冷PBS輕輕重懸細(xì)胞,2000 rpm 5 min,小心吸除上清;重復(fù)洗滌一次。

2.2.5細(xì)胞沉淀中加入適量Annexin V-FITC結(jié)合液,制成終濃度為1×106 個/ml的細(xì)胞懸液。

注:加入結(jié)合液的體積根據(jù)實驗?zāi)康淖孕姓{(diào)整,一般推薦不少于500 μl。

2.2.6 取100 μl步驟2.2.5中制備的細(xì)胞懸液,加入到一個新的離心管中。

2.2.7 向細(xì)胞懸液中加入5 μl Annexin V-FITC,再加入5 μl 碘化丙啶染色液。

2.2.8 常溫下避光放置15 min,即為待檢液。

2.3 結(jié)果檢測:

2.3.1 流式細(xì)胞儀檢測:

步驟2.2.8中的待檢液中加入400 μl Annexin V-FITC結(jié)合液。激發(fā)波長Ex = 488 nm;發(fā)射波長Em = 530 nm。Annexin V-FITC的綠色熒光通過FITC通道 (FL1) 檢測;PI的紅色熒光通過PI 通道 (FL2或FL3) 檢測。注:熒光染料都存在淬滅的問題,建議1小時內(nèi)完成檢測。

2.3.2 熒光顯微鏡檢測:

取步驟2.2.8的待檢液5 μl滴于載玻片上,加5μl 抗熒光淬滅封片液,封片觀察。



檢測程序:

Jurkat細(xì)胞調(diào)整到1×106/ml,6孔板接種2 ml;凋亡處理加10 μl 0.2 M STS(星型飽菌素),終濃度為1 μM;37度 5%二氧化碳培養(yǎng)3小時;2 ml收集,PBS漂洗2次,重懸于300 μl 結(jié)合液中;調(diào)整細(xì)胞密度為1×106/ml制成細(xì)胞懸液。取100 μl細(xì)胞懸液加5 μl Annexin V-FITC,5 μl 碘化丙啶染色液,RT 避光靜置15min,取5 μl加5 μl封片液,封片觀察。FITC(+)PI(+)為凋亡晚期細(xì)胞(40×)。

注意事項:

1. 本試劑盒適用于檢測活細(xì)胞,流式細(xì)胞儀檢測時,細(xì)胞數(shù)量不應(yīng)低于1×106,不推薦用于檢測組織樣本。

2. 推薦使用懸浮培養(yǎng)細(xì)胞。如果是貼壁細(xì)胞,需用不含 EDTA 的胰酶消化,如消化不當(dāng),可能引起假陽性,而用細(xì)胞刮子會造成細(xì)胞粘連成團,而影響檢測。

3. 細(xì)胞固定后可能導(dǎo)致熒光的淬滅,請不要固定樣品。

4. 消化貼壁細(xì)胞殘留的胰酶會消化并降解Annexin V-FITC,最終導(dǎo)致染色失敗。

5 .因檢測細(xì)胞的類型、凋亡誘導(dǎo)劑種類、使用的檢測儀器不同,因而流式檢測的熒光補償也不同,因此建議每次檢測均需使用未經(jīng)凋亡誘導(dǎo)處理的細(xì)胞作為對照,進行熒光補償?shù)恼{(diào)節(jié)。


 
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