超濾離心管的使用
注：本文引自“分子莊園”公眾號(hào)，略有修改。
超濾離心管是一種膜過(guò)濾設(shè)備，是用于分離液體中不同分子或粒子的裝置。它利用特殊的超濾膜，通過(guò)應(yīng)用壓力將液體樣品推動(dòng)穿過(guò)膜，從而分離不同分子或粒子的大小，廣泛用于蛋白質(zhì)、DNA和生物分子的濃縮、純化和脫鹽。
一、超濾與微濾
1、微濾
微濾 (Microfiltration) 涉及利用微孔膜介質(zhì)去除溶液中尺寸為 0.1 μm 至 10.0 μm 的顆粒或生物體。而超濾膜的過(guò)濾范圍為0.01μm至0.1μm。
微濾膜廣泛應(yīng)用于生物制藥行業(yè)中的預(yù)過(guò)濾和除菌過(guò)濾。 在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，微濾最常用于樣品和培養(yǎng)基的滅菌（0.1μm微濾膜可去除支原體）。
此外，在核酸和蛋白質(zhì)分析之前，使用微濾膜可以有效地從細(xì)胞裂解物中去除完整的細(xì)胞和細(xì)胞碎片。 此步驟對(duì)于確保下游應(yīng)用中結(jié)果的準(zhǔn)確性至關(guān)重要。 通過(guò)微濾，研究人員可以獲得純化的樣品，從而提高核酸和蛋白質(zhì)相關(guān)研究的靈敏度和特異性。
2、超濾
超濾 (Ultrafiltration) 也是一種膜過(guò)濾，通過(guò)壓力或濃度梯度等力使料液通過(guò)半透膜進(jìn)行分離。 超濾膜能夠截留尺寸范圍為1-1000kDa（MW）的分子，并允許鹽和水等小分子通過(guò)。
超濾是大分子脫鹽、濃縮最方便的方法，已經(jīng)在蛋白、抗體、病毒、核酸、囊泡等樣品制備中建立標(biāo)準(zhǔn)操作。與沉淀法相比，超濾法更為溫和，避免了可能導(dǎo)致生物大分子失活的相變。
水流的方向垂直于膜的表面，能最大限度的提高水通量，在壓力差的作用下，水和小于膜孔的顆粒或物質(zhì)透過(guò)膜，大于膜孔的顆粒則被膜截留。死端過(guò)濾隨著過(guò)濾時(shí)間的延長(zhǎng)，被截留顆粒將在膜表面形成污染層，阻塞膜孔，使過(guò)濾阻力增加，在操作壓力不變的情況下，膜的過(guò)濾透過(guò)率將下降；而增加壓力則可能是膜破裂。因此，死端過(guò)濾只能間歇進(jìn)行，必須周期性地清除膜表面的污染物層或更換膜。又叫錯(cuò)流過(guò)濾（cross flow filtration）：水流的方向平行于膜的表面，可以大量減少污染物在表面的富集，因?yàn)樗鲿?huì)將其帶走，同時(shí)也減少了堵孔的概率，使膜的通量能夠保持，同時(shí)，膜上面承受的壓力也更小，可以延長(zhǎng)膜的使用壽命。錯(cuò)流過(guò)濾運(yùn)行時(shí)，水流在膜表面產(chǎn)生兩個(gè)分力，一個(gè)是垂直于膜面的法向力，使水分子透過(guò)膜面，另一種是平行于膜面的切向力，把膜面的截留物沖刷掉。因此，錯(cuò)流過(guò)濾的濾膜表面不易產(chǎn)生濃差極化現(xiàn)象和結(jié)垢問(wèn)題，過(guò)濾透過(guò)率衰減較慢。錯(cuò)流過(guò)濾的運(yùn)行方式比較靈活，既可以間歇運(yùn)行，又可以實(shí)現(xiàn)連續(xù)運(yùn)行。
三、超濾離心管
超濾離心管是一種利用離心力驅(qū)動(dòng)中小體積溶液通過(guò)超濾膜，進(jìn)行快速濃縮、滲濾和緩沖液置換的裝置。 它由蓋子、過(guò)濾裝置和離心管組成。
中間的過(guò)濾裝置既可用于滲透樣品，也可以用于保留樣品。當(dāng)目標(biāo)分子明顯小于濾膜孔徑時(shí)，可使用超濾離心管對(duì)大分子污染物進(jìn)行除熱源、澄清和分離。目標(biāo)樣品會(huì)透過(guò)濾膜并保留在離心管內(nèi)。如果目標(biāo)分子遠(yuǎn)大于膜孔徑，則小分子污染物將被濾除，目標(biāo)分子將集中在過(guò)濾裝置中。1、超濾管的優(yōu)勢(shì)設(shè)計(jì)垂直設(shè)計(jì)的超濾膜具有更大的有效濾膜表面積，有助于快速的樣本處理，獲得較高的樣本回收率（通常>90%），并達(dá)到數(shù)十倍的濃縮，同時(shí)也最大程度降低了大顆?；虼蠓肿恿课镔|(zhì)堵塞濾膜。死體積設(shè)計(jì)能有效防止過(guò)度離心使樣本干掉而造成樣本損失。
收集濾出液后，濃縮樣本（截留部分）可通過(guò)一個(gè)簡(jiǎn)便的倒置（上下反轉(zhuǎn)）離心步驟而實(shí)現(xiàn)高效回收。反轉(zhuǎn)離心回收設(shè)計(jì)使蛋白樣品，特別是小體積樣品得到高效回收，避免槍頭吸取造成的樣品丟失或操作錯(cuò)誤。
超濾管采用切向流過(guò)濾技術(shù)，是一種以篩分為分離原理，以壓力為推動(dòng)力的膜分離過(guò)程。用于截留水中顆粒和大分子物質(zhì)，而水和小分子物質(zhì)則允許透過(guò)膜，過(guò)濾精度在0.001-0.01μm（分子量1kD-1000kD）范圍內(nèi)，可有效除去有機(jī)溶劑或者小分子物質(zhì)，相反，也可以截留水中的微粒、膠體、細(xì)菌、熱源及高分子聚合物。選擇超濾離心管需要考慮樣品起始量以及超濾膜的截留分子量(MWCO)。影響截留和產(chǎn)物回收率的因素有很多，如分子構(gòu)象、帶電特性、樣品濃度、操作條件等。而且超濾管上的截留分子量只是平均孔徑，實(shí)際孔徑是在左右正太分布的。
一般建議選擇截留分子量要比要濃縮的目標(biāo)大分子的分子量小2-3倍的超濾膜，然后根據(jù)要處理的樣品體積選擇不同尺寸的超濾離心管。
為防超濾膜干裂和長(zhǎng)菌，通常超濾離心管內(nèi)會(huì)附帶少量甘油和疊氮化鈉用于保護(hù)和儲(chǔ)存，在使用前需潤(rùn)洗去除。一般是向超濾裝置中加入純水、去離子水或緩沖溶液，離心使溶液完全過(guò)膜，然后離心管中的所有液體。如果干擾仍然存在，可用0.1 M NaOH清洗，再用20％的乙醇清洗，最后用緩沖液或超純水水清洗并甩干。超濾膜一旦潤(rùn)濕后就需保持濕潤(rùn)避免變干直至使用結(jié)束，如果預(yù)清洗后沒(méi)有立即使用，可用20％的乙醇浸泡保存，務(wù)必保持濾膜潤(rùn)濕，防止長(zhǎng)菌。
5、超濾管的放置
超濾管在離心機(jī)中的擺放需要符合切向流過(guò)濾要求，即水流方向與膜面平行。
1）水平轉(zhuǎn)子
使用水平轉(zhuǎn)子時(shí)放置沒(méi)有特殊要求。
水平轉(zhuǎn)子又稱甩平轉(zhuǎn)子、蕩平轉(zhuǎn)子，轉(zhuǎn)頭靜止時(shí)，處于轉(zhuǎn)頭中的離心管中心線與旋轉(zhuǎn)軸平行，轉(zhuǎn)頭旋轉(zhuǎn)加速時(shí)，離心管中心線由平行位置逐漸過(guò)渡到垂直位置，即與旋轉(zhuǎn)軸成90?角。此種轉(zhuǎn)子主要用于樣品做密度梯度離心，顆粒移動(dòng)距離長(zhǎng)，相應(yīng)離心時(shí)間一般也較長(zhǎng)，溶液中的組分相對(duì)于管壁的位置在離心過(guò)程中和離心后不發(fā)生改變，因此離心效果好，能夠分離密度差小的樣品。
2）固定角轉(zhuǎn)子
使用角轉(zhuǎn)子時(shí)，雙面垂直膜超濾管放置方式要求濾膜側(cè)向相對(duì)。
單面垂直膜要求濾膜膜面朝下，這樣濾膜才能發(fā)揮切向流的作用。
有尖角的超濾管應(yīng)使尖角朝上以便樣品進(jìn)入尖角，讓樣品收集更加方便，此外，死體積設(shè)計(jì)能有效防止過(guò)度離心使樣本干掉而造成樣本損失。固定角轉(zhuǎn)子中離心管與轉(zhuǎn)子的轉(zhuǎn)軸之間有一定的角度，角度變化范圍通常在14?-45?。此種轉(zhuǎn)子重心低，壽命長(zhǎng)，容量較大，轉(zhuǎn)速較高，能承受的最大離心力可達(dá)800000g，主要用于分離沉降速度有明顯差異的顆粒樣品。顆粒在扇形溶液移動(dòng)的距離很短，碰到外壁的顆粒沿著管壁滑到管底，形成沉淀，因此這種轉(zhuǎn)子能很快地收集沉淀物。
6、超濾管的截留分子量和膜孔徑關(guān)系
超濾管是一種膜過(guò)濾設(shè)備，用于分離液體中不同分子或粒子的裝置。它利用特殊的超濾膜，通過(guò)應(yīng)用壓力將液體樣品推動(dòng)穿過(guò)膜，從而分離不同分子或粒子的大小。這種分離過(guò)程基于分子截留量，也就是膜的孔徑大小，決定了哪些分子可以通過(guò)膜，哪些分子被截留在膜上。
分子截留量是表示超濾膜的選擇性的重要參數(shù)，通常以道爾頓（Da）為單位，分子截留率表示膜可以截留的最大分子或粒子的大小。具體來(lái)說(shuō)，如果膜的分子截留率是10kD，則該膜能夠截留分子量小于或等于10000的分子，而分子量大于10000的分子將被截留在膜上。
道爾頓是用來(lái)表示分子質(zhì)量或原子質(zhì)量的單位，一個(gè)分子的道爾頓數(shù)值大約等于其相對(duì)原子質(zhì)量或相對(duì)分子質(zhì)量。
截留分子量和孔徑之間的關(guān)系是復(fù)雜的。通常超濾膜的截留分子量是指在一定條件下,某些分子量的物質(zhì)被膜截留，被截住物質(zhì)的最小分子量即為膜的截留分子量，用以表征膜的分離能力；而孔徑則是反映膜的通透性的重要參數(shù)。分子量通常用單位為Dalton(Da)表示，而孔徑大小通常用單位為納米(nm)表示。
超濾膜截留的分子量10000、30000、50000 60000、100000、200000、300000、500000、1000000，對(duì)應(yīng)超濾膜孔徑(μm) 0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.1。也就是說(shuō)100kd（10萬(wàn)）的截留分子量對(duì)應(yīng)50nm的孔徑。
從數(shù)據(jù)上看,似乎存在一種對(duì)應(yīng)關(guān)系，如超濾膜截留分子量為100kD（10萬(wàn)）時(shí),對(duì)應(yīng)的孔徑為0.05μm。但這種關(guān)系并不完全準(zhǔn)確。因?yàn)槌瑸V膜的孔徑和分子量的關(guān)聯(lián)并非簡(jiǎn)單的線性關(guān)系，對(duì)于具體的過(guò)濾器或分離膜，其材料、制備方法、孔徑大小分布等因素都會(huì)影響它們之間的關(guān)系。
7、超濾管的離心
超濾管如果離心轉(zhuǎn)速過(guò)高，可能會(huì)導(dǎo)致膜甚至管子的破裂，做實(shí)驗(yàn)時(shí)要根據(jù)不同品牌超濾管的說(shuō)明書中明確指出的最大轉(zhuǎn)速和離心力，調(diào)整離心轉(zhuǎn)速到超濾管的承受范圍內(nèi)。
離心機(jī)的轉(zhuǎn)速與離心機(jī)的半徑以及離心力都有關(guān)系，不同半徑的離心機(jī)，相同轉(zhuǎn)速出來(lái)的離心力也不一樣。離心力g和rpm（轉(zhuǎn)／min）轉(zhuǎn)換公式：g=r×11.8×10??×rpm2，其中g(shù)有時(shí)用相對(duì)離心力（RCF）表示。
r 為有效離心半徑，即從離心機(jī)軸心到離心管底的長(zhǎng)度，單位為厘米（cm）。
8、超濾管使用建議
1）超濾管不能進(jìn)行高壓滅菌，可使用70%乙醇或環(huán)氧乙烷滅菌。
2）超濾管一般不建議重復(fù)使用超過(guò)5次。受到樣品性質(zhì)的影響，先用0.1M的NaOH浸泡1-2h，然后用20%乙醇清洗，最后用超純水或緩沖液清洗3次，即可再用。
3、如果樣品是線性蛋白，需使用較低的離心速度和時(shí)間避免蛋白降解。
4、濃縮過(guò)快或者過(guò)度濃縮可能會(huì)引起蛋白沉淀。建議蛋白濃縮后最終濃度不超過(guò)20mg/ml，同時(shí)降低離心速度并改用截留分子量更大的超濾管。
建議的改進(jìn)方法是：①離心力降為推薦離心力的30%-50%；②改用截留分子量大的超濾管(如原本選用10kD，此時(shí)可以選擇30kD)；③取出超濾管, 用吸頭反復(fù)吹吸幾次后再繼續(xù)濃縮。
6、過(guò)濾速率受到超濾管MWCO，樣品濃度，粘度，離心力和溫度的影響。如果樣品中固體含量超過(guò)5%，離心時(shí)間需要增加。當(dāng)在4℃下運(yùn)行時(shí)，流速大約比25℃時(shí)慢1.5倍。粘性溶液(如50%甘油)的濃縮時(shí)間大概是常規(guī)溶液的5倍。
7、如果要用超濾的方法分離兩種蛋白，按照經(jīng)驗(yàn)，兩個(gè)蛋白的分子量要相差一個(gè)數(shù)量級(jí)（10 倍）。
8、擔(dān)心濃縮過(guò)程中目的蛋白和超濾膜之間可能存在非特異性吸附，可嘗試以下操作：①確保蛋白濃度不要過(guò)低；②盡量選用纖維素的低吸附超濾；③選用小體積超濾管，通過(guò)減小膜面積來(lái)降低非特異性吸附；④使用前可以先對(duì)膜進(jìn)行封閉：1%脫脂奶粉，1%BSA，5%Tween 20，5%SDS，5%TritonX-100，5%PEG3000（不影響蛋白活性，不影響蛋白后續(xù)使用的前提下）。
9、對(duì)于有些樣品含量非常少的情況，可嘗試一下操作：①盡量選擇較小的截留分子量的超濾管；②選擇帶有尖角收集器的超濾管以便最大限度回收樣品；③使用水平轉(zhuǎn)子優(yōu)于角轉(zhuǎn)子；④濃縮完用緩沖液清洗多次回收, 注意移液器的槍頭不要碰到膜，以免膜破裂；⑤使用前可以先對(duì)膜進(jìn)行封閉。